Die Wirkung der PPI-Therapie auf Gewicht, Darmmikrobiom und Expression von GPR41 und GPR43

Forschungsplan:

Patienten ohne gastrointestinale Symptome, bei denen eine Screening- oder Überwachungskoloskopie (für Darmkrebs) im UCH-Endoskopielabor geplant ist, werden anhand der Einschluss- und Ausschlusskriterien für die Studie untersucht. Bei geeigneten Patienten, die der Studie zustimmen, werden Größe, Gewicht und demografische Daten gemessen und aufgezeichnet. Sie werden einen Fragebogen zur Gewichts-/Ernährungsgeschichte ausfüllen. Die Patienten werden einer Screening-/Überwachungskoloskopie gemäß routinemäßiger klinischer Behandlung unterzogen. Restlicher Stuhl wird standardmäßig durch das Koloskop abgesaugt, um eine vollständige Visualisierung der Schleimhaut zu gewährleisten und die Erkennung von Polypen zu verbessern. Wir werden Stuhlaspirate von drei verschiedenen Stellen entnehmen: Sigma, Blinddarm und terminales Ileum. Es gibt Hinweise darauf, dass eine Darmvorbereitung (vor der Koloskopie) die Zusammensetzung der Darmmikrobiota bei den meisten Probanden nicht wesentlich verändert. An jeder dieser drei Stellen werden wir außerdem vier kleine Pinch-Biopsien entnehmen. Stuhlaspirate und Biopsieproben werden in flüssigem N2 eingefroren und bei -80 °C eingefroren, bis sie für ihre Untersuchungen benötigt werden.

Wir werden insgesamt 48 Probanden einschreiben, die zu gleichen Teilen auf vier Gruppen aufgeteilt sind: OB/PPI, OB/Nicht-PPI, NW/PPI und NW/Nicht-PPI. Ungefähr 40–50 Patienten pro Woche, die die oben genannten Einschluss-/Ausschlusskriterien erfüllen, werden einer Screening-/Überwachungskoloskopie am UCH unterzogen, sodass die Rekrutierung von 2–3 Patienten/Woche über 6–9 Monate realistisch ist, um eine gezielte Rekrutierung zu erreichen.

Ziel 1: Untersuchung der Auswirkungen der PPI-Verwendung auf die Darmmikrobiota im Dickdarm und im terminalen Ileum von normalgewichtigen (NW) und adipösen (OB) Patienten. Darmmikrobiome werden durch 16S-rRNA-Sequenzierung profiliert, um PPI-assoziierte Veränderungen in der Darmbiodiversität zu identifizieren.

Für Stuhlaspirate und Schleimhautbiopsien aus dem Sigma, dem Blinddarm und dem terminalen Ileum werden separate sterile Probensammelbehälter verwendet. Für die Mikrobiomanalyse wird Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung eingesetzt.

Mikrobiom-16S-rRNA-Profiling Die gesamte genomische DNA der Gemeinschaft wird aus Darmproben hergestellt und 16S-rRNA-Gene wie zuvor beschrieben per PCR amplifiziert. Es wird eine Paired-End-Multiplex-Sequenzierung durchgeführt. In einem einzigen Lauf werden 10–20 Millionen DNA-Sequenzen und pro Probe 100.000 rRNA-Reads generiert, um eine Sequenzabdeckung von >99 % zu gewährleisten. Demultiplexing, Qualitätsfilterung, Chimärenentfernung und Sequenzklassifizierung (unter Verwendung von SINA/Silva) folgen früheren Veröffentlichungen. Ähnliche Sequenzen werden auf der Grundlage der Taxonomie in operative taxonomische Einheiten (OTUs) gruppiert.

Mikrobiom-Datenanalyse Das Hauptergebnis ist die prozentuale relative Häufigkeit (PRA) von Mikrobengruppen, und wir gehen davon aus, dass diese zwischen PPI-Anwendern und Nichtanwendern von säureunterdrückenden Medikamenten unterschiedlich sein wird. Spezifische mikrobielle Gruppen (Arten/Gattungen/Phyla), die sich zwischen Versuchsgruppen unterscheiden, werden mithilfe einer nichtparametrischen zweiteiligen Statistik identifiziert.40 Statistische Analysen werden mit = 0,05 bewertet und die p-Werte werden um die Falscherkennungsrate (FDR) korrigiert.41 Die Ergebnisse werden durch artspezifische QPCR validiert.

Ziel 2: Bestimmung, ob die Verwendung von PPI die relative Menge an Darmbakterien-RNA verändert, die für den Fermentationszyklus bei NW- und OB-Personen bestimmt ist. Wir werden eine Shotgun-Sequenzierung von Massen-RNA durchführen, die aus Darmmikrobiomen hergestellt wurde, um mikrobielle Stoffwechselwege zu identifizieren, die bei Patienten unter PPI unterschiedlich exprimiert werden. Stuhlaspirate aus dem terminalen Ileum, dem Blinddarm und dem Sigma werden wie oben beschrieben entnommen.

RNA-Isolierung und -Sequenzierung Mikrobielle RNA wird mit dem RiboPure Bacteria Extraction Kit (Life Technologies Inc., USA) aus 50 mg Stuhlaspiraten extrahiert. Für dieses Pilotprojekt werden wir Proben von insgesamt 48 Probanden untersuchen, die zu gleichen Teilen auf vier Gruppen aufgeteilt sind: OB/PPI, OB/Nicht-PPI, NW/PPI und NW/Nicht-PPI. Wirts- und mikrobielle rRNA werden mit den Ribo-Zero-Bakterien- und Ribo-Zero-Maus-Kits (Epicentre, Inc, USA) entfernt. RNA-Proben werden für die Sequenzierung mit den ScriptSeq v2 RNA-Seq (Bakterien)-Kits (Epicentre, Inc, USA) vorbereitet. Die Sequenzierung wird auf einer Illumina HiSeq2000-Plattform (UC-Denver Microarray und Genomics Core) durchgeführt, die eine hohe Abdeckungstiefe bietet. Zur Qualitätssicherung der Reproduzierbarkeit werden zwei mRNA-Proben jeder Probe gepoolt und sequenziert. In diesem Pilotexperiment werden wir für jeden mikrobiellen Meta-Transkriptom-Datensatz ca. 20 x 106 Single-End-150-Base-Reads pro Probe generieren.

Metatranskriptom-Datenanalyse Die Annotation und Aufzählung bakterieller Transkripte erfolgt auf Peptidebene mithilfe von BLASTX-Suchen anhand der etwa 1800 derzeit in GenBank verfügbaren bakteriellen Genomsequenzen sowie der nicht-redundanten Proteindatenbank von NCBI unter Verwendung eines E-Wert-Grenzwerts von <10- 5.44 Funktionsunterschiede auf breiter Ebene zwischen Proben werden mithilfe von Anmerkungen bewertet, die mit den Tools COG,47 KEGG48 und RAST/SEED generiert wurden.49, 50 Die statistische Analyse enterischer mikrobieller Transkriptome wird sich auf die Identifizierung von Stoffwechselwegen konzentrieren, die zwischen Gruppen unterschiedlich ausgedrückt werden.44 Gene mit qualitativ hochwertigen Annotationen (E<10-5) werden verwendet, um eine NxM-Matrix von Genen (M) zu erstellen, indem Probanden (N) die Anzahl der für ein bestimmtes Gen und Subjekt annotierten Sequenzablesungen aufzeichnen. Eine ähnliche NxM-Matrix von Genkategorien (M) nach Probanden (N) wird erstellt, um die Verteilung der Sequenzablesungen, die Funktionskategorien zugeordnet sind, tabellarisch darzustellen. Gene oder Genkategorien, die sich in der Prävalenz oder Häufigkeit zwischen den Behandlungsgruppen unterscheiden, werden durch den exakten Fisher-Test bzw. Kruskal-Wallis-Test identifiziert, der auf jedes Gen/jede Kategorie in der Matrix angewendet wird. Die Signifikanz wird nach Korrektur für FDR.41 mit = 0,05 bewertet. P-Werte werden verwendet, um eine Kandidatengenliste für die Folgevalidierung mithilfe von QPCR zu priorisieren, um die Genexpression in der gesamten Patientenkohorte zu untersuchen.

Ziel 3: Bestimmung des Ausmaßes, in dem die Verwendung von PPI die Expression von GPR41, GPR43 und ihren Effektorgenen im Dickdarm und terminalen Ileum von NW- und OB-Patienten verändert. Biopsieproben werden einer Reihe von RT-QPCR-Assays unterzogen, um die Expression von Zielgenen zu überwachen, die durch die mikrobielle SCFA-Produktion beeinflusst werden. Biopsien aus dem terminalen Ileum, dem Blinddarm und dem Sigma werden wie oben beschrieben entnommen.

Quantitative Reverse-Transkriptase-PCR-Analyse (qRT-PCR) Die Gesamt-RNA wird mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen) und ISOGEN (WAKO) extrahiert. Komplementäre DNAs werden unter Verwendung von RNAs als Matrizen mit der Reversen Transkriptase des Moloney-Maus-Leukämievirus (Invitrogen) transkribiert. cDNAs werden durch PCR mit Taq-DNA-Polymerase (TaKaRa) unter Verwendung der entsprechenden Primer amplifiziert. qRT-PCR-Analysen werden mit DNA Engine Opticon-2 (MJ Research) durchgeführt. Der Ausdruck wird in zweifacher Ausfertigung quantifiziert.

Stichprobengröße und Leistungsanalyse:

Wir werden 24 NW- und 24 adipöse (OB) Teilnehmer einschreiben. Die Hälfte der NW- und OB-Gruppen werden PPI-Anwender sein und die andere Hälfte werden keine säureunterdrückenden Medikamente einnehmen. Das primäre Ergebnis für Ziel 1 ist der Unterschied in der PRA von Firmicutes und Bacteroidetes. Es wird eine Zwei-Wege-ANOVA (Faktoren der BMI-Kategorie und PPI-Nutzung) verwendet. Basierend auf unseren vorläufigen Daten werden wir eine Aussagekraft von 94 % haben, um einen Unterschied in der PRA von Firmicutes zu erkennen (72 % vs. 52 % mit SD von 20 %) und eine Aussagekraft von 95 %, um Unterschiede in der PRA von Bacteroidetes zu erkennen (16 % vs. 5). % mit SD von 5 %) zwischen PPI-Benutzern und Nicht-Benutzern. Das primäre Ergebnis für Ziel 2 ist der Unterschied in der bakteriellen RNA, die dem Fermentationszyklus gewidmet ist, während das Ergebnis für Ziel 3 der Unterschied in der Expression von GPR 41 und GPR 43 ist. Basierend auf den erwarteten Unterschieden im Darmmikrobiota-Profil und der anschließenden SCFA-Produktion erwarten wir für beide Ergebnisse einen Unterschied von 25 % zwischen PPI-Benutzern und Nicht-Benutzern, was uns eine Aussagekraft von 99 % für beide Ziele 2 und 3 gibt. Wir werden auch Untergruppenanalysen innerhalb der NW- und OB-Gruppen durchführen.