Wpływ terapii PPI na wagę, mikrobiom jelitowy i ekspresję GPR41 i GPR43

Plan badań:

Pacjenci bez objawów żołądkowo-jelitowych zakwalifikowani do kolonoskopii przesiewowej lub kontrolnej (w przypadku raka jelita grubego) w laboratorium endoskopii UCH zostaną poddani badaniu przesiewowemu na podstawie kryteriów włączenia i wyłączenia. Kwalifikujący się pacjenci, którzy wyrażą zgodę na badanie, będą mieli mierzony i rejestrowany wzrost, wagę i informacje demograficzne. Wypełnią kwestionariusz historii wagi / diety. Pacjenci zostaną poddani kolonoskopii przesiewowej/obserwacyjnej w ramach rutynowej opieki klinicznej. Resztki stolca są standardowo odsysane przez kolonoskop, aby zapewnić pełną wizualizację błony śluzowej i poprawić wykrywanie polipów. Pobierzemy próbki stolca z trzech oddzielnych miejsc: okrężnicy esowatej, jelita ślepego i końcowego odcinka jelita krętego. Dowody sugerują, że przygotowanie jelita (przed kolonoskopią) nie zmienia znacząco składu mikroflory jelitowej u większości badanych. Pobierzemy również cztery małe, szczyptowe biopsje w każdym z tych trzech miejsc. Aspiraty kału i próbki biopsji zostaną szybko zamrożone w ciekłym N2 i zamrożone w temperaturze -80°C do czasu, gdy będą potrzebne do ich testów.

Zarejestrujemy łącznie 48 przedmiotów podzielonych po równo na cztery grupy: OB/PPI, OB/non-PPI, NW/PPI i NW/non-PPI. Około 40-50 pacjentów tygodniowo spełniających powyższe kryteria włączenia/wyłączenia jest poddawanych przesiewowej/nadzorowanej kolonoskopii w UCH, co sprawia, że ​​rekrutacja 2-3 pacjentów/tydzień w ciągu 6-9 miesięcy jest realistyczna, aby osiągnąć docelową rekrutację.

Cel 1: Zbadanie wpływu stosowania PPI na mikroflorę jelitową w okrężnicy i końcowym odcinku jelita krętego pacjentów o normalnej masie ciała (NW) i otyłych (OB). Mikrobiomy jelitowe zostaną profilowane za pomocą sekwencjonowania 16S rRNA w celu zidentyfikowania zmian związanych z PPI w różnorodności biologicznej jelit.

Oddzielne sterylne pojemniki do pobierania próbek będą używane do aspiratów kału i biopsji błony śluzowej z esicy, jelita ślepego i końcowego odcinka jelita krętego. Zastosowane zostanie wysokowydajne sekwencjonowanie DNA do analizy mikrobiomu.

Profilowanie mikrobiomu 16S rRNA Całkowity genomowy DNA społeczności zostanie przygotowany z próbek jelitowych, a geny 16S rRNA powielone metodą PCR, jak opisano wcześniej. Przeprowadzone zostanie sekwencjonowanie multipleksowane ze sparowanymi końcami. W jednym przebiegu zostanie wygenerowanych 10-20 milionów sekwencji DNA i 100 000 odczytów rRNA na próbkę, aby zapewnić >99% pokrycie sekwencji. Demultipleksowanie, filtrowanie jakości, usuwanie chimer i klasyfikacja sekwencji (za pomocą SINA/Silva) nastąpi po poprzednich publikacjach. Podobne sekwencje są pogrupowane w operacyjne jednostki taksonomiczne (OTU) na podstawie taksonomii.

Analiza danych dotyczących mikrobiomu Głównym wynikiem jest procent względnej obfitości (PRA) grup drobnoustrojów i przypuszczamy, że będzie się on różnić między użytkownikami PPI a osobami niestosującymi leków zmniejszających wydzielanie kwasu. Konkretne grupy drobnoustrojów (gatunki/rodzaje/typy), które różnią się między grupami doświadczalnymi, zostaną zidentyfikowane przy użyciu nieparametrycznej statystyki dwuczęściowej.40 Analizy statystyczne zostaną ocenione na poziomie = 0,05, a wartości p zostaną skorygowane o współczynnik fałszywych odkryć (FDR).41 Wyniki zostaną zweryfikowane za pomocą specyficznego dla gatunku QPCR.

Cel 2: Określenie, czy stosowanie PPI zmienia względną ilość bakteryjnego RNA jelitowego przeznaczonego na cykl fermentacji u osobników NW i OB. Przeprowadzimy sekwencjonowanie strzelby RNA przygotowanego z mikrobiomów jelitowych, aby zidentyfikować szlaki metaboliczne drobnoustrojów ulegające różnej ekspresji u pacjentów stosujących PPI. Aspiraty kału z końcowego odcinka jelita krętego, jelita ślepego i esicy zostaną uzyskane w sposób opisany powyżej.

Izolacja i sekwencjonowanie RNA Mikrobiologiczny RNA zostanie wyekstrahowany z 50 mg aspiratów kałowych przy użyciu zestawu do ekstrakcji RiboPure Bacteria (Life Technologies Inc., USA). W ramach tego pilotażu przeanalizujemy próbki od łącznie 48 pacjentów podzielonych równo między cztery grupy: OB/PPI, OB/non-PPI, NW/PPI i NW/non-PPI. RRNA gospodarza i mikroorganizmów zostanie usunięty przy użyciu zestawu bakterii Ribo-Zero i myszy Ribo-Zero (Epicentre, Inc, USA). Próbki RNA zostaną przygotowane do sekwencjonowania przy użyciu zestawów ScriptSeq v2 RNA-Seq (bakterie) (Epicentre, Inc, USA). Sekwencjonowanie zostanie przeprowadzone na platformie Illumina HiSeq2000 (UC-Denver Microarray i Genomics Core), która zapewnia dużą głębokość pokrycia. W celu zapewnienia jakości odtwarzalności dwie próbki mRNA z każdej próbki zostaną zebrane i zsekwencjonowane. W tym eksperymencie pilotażowym wygenerujemy ~ 20x106 pojedynczych odczytów 150-zasadowych na próbkę dla każdego zestawu danych meta-transkryptomu drobnoustrojów.

Analiza danych metatranskryptomu Adnotacja i zliczanie transkryptów bakteryjnych zostanie przeprowadzone na poziomie peptydu przy użyciu wyszukiwania BLASTX w stosunku do około 1800 sekwencji genomu bakteryjnego dostępnych obecnie w GenBank, jak również w bazie danych nieredundantnych białek NCBI przy użyciu wartości odcięcia E <10- 5.44 Różnice funkcjonalne na szerokim poziomie między próbkami zostaną ocenione przy użyciu adnotacji generowanych za pomocą narzędzi COG47 KEGG48 i RAST/SEED49, 50 Analiza statystyczna transkryptomów drobnoustrojów jelitowych skupi się na identyfikacji szlaków metabolicznych, których ekspresja jest różna w różnych grupach.44 Geny z adnotacjami wysokiej jakości (E<10-5) zostaną wykorzystane do skonstruowania macierzy NxM genów (M) przez osobników (N) rejestrujących liczbę odczytów sekwencji z adnotacjami dla danego genu i osobnika. Podobna macierz NxM kategorii genów (M) według podmiotów (N) zostanie skonstruowana w celu zestawienia rozkładu odczytów sekwencji przypisanych do kategorii funkcjonalnych. Geny lub kategorie genów, które różnią się występowaniem lub liczebnością między grupami leczonymi, zostaną zidentyfikowane odpowiednio za pomocą dokładnego testu Fishera lub testu Kruskala-Wallisa, zastosowanego do każdego genu/kategorii w macierzy. Istotność zostanie oceniona na poziomie = 0,05, po korekcie na FDR.41 Wartości P zostaną wykorzystane do nadania priorytetu liście genów kandydujących do dalszej walidacji przy użyciu QPCR w celu zbadania ekspresji genów w całej kohorcie pacjentów.

Cel 3: Określenie, w jakim stopniu stosowanie PPI zmienia ekspresję GPR41, GPR43 i ich genów efektorowych w okrężnicy i końcowym odcinku jelita krętego pacjentów z NW i OB. Próbki z biopsji zostaną poddane panelowi testów RT-QPCR w celu monitorowania ekspresji genów docelowych, na które wpływa wytwarzanie SCFA przez drobnoustroje. Biopsje końcowego odcinka jelita krętego, jelita ślepego i esicy zostaną uzyskane w sposób opisany powyżej.

Ilościowa analiza PCR z odwrotną transkryptazą (qRT-PCR) Całkowity RNA zostanie wyekstrahowany przy użyciu zestawu RNeasy Mini Kit (Qiagen) i ISOGEN (WAKO). Komplementarne DNA będzie transkrybowane przy użyciu RNA jako matryc z odwrotną transkryptazą wirusa mysiej białaczki Moloneya (Invitrogen). cDNA zostaną zamplifikowane metodą PCR z użyciem polimerazy Taq DNA (TaKaRa) przy użyciu odpowiednich starterów. Analizy qRT-PCR zostaną przeprowadzone przy użyciu DNA Engine Opticon-2 (MJ Research). Wyrażenie zostanie określone ilościowo w dwóch powtórzeniach.

Wielkość próbki i analiza mocy:

Zarejestrujemy 24 uczestników NW i 24 otyłych (OB). Połowa grup NW i OB będzie używała PPI, a połowa nie będzie używała leków tłumiących kwas. Podstawowym wynikiem dla Celu 1 jest różnica w PRA Firmicutes i Bacteroidetes. Zastosowana zostanie dwukierunkowa ANOVA (czynniki kategorii BMI i wykorzystanie PPI). Na podstawie naszych wstępnych danych będziemy mieli 94% mocy do wykrycia różnicy w PRA Firmicutes (72% vs 52% przy SD 20%) i 95% mocy do wykrycia różnic w PRA Bacteroidetes (16% vs 5 % z odchyleniem standardowym wynoszącym 5%) między użytkownikami PPI a osobami niebędącymi użytkownikami. Podstawowym wynikiem dla Celu 2 jest różnica w bakteryjnym RNA poświęconym cyklowi fermentacji, podczas gdy wynikiem dla Celu 3 jest różnica w ekspresji GPR 41 i GPR 43. Na podstawie oczekiwanych różnic w profilu mikroflory jelitowej i późniejszej produkcji SCFA, spodziewamy się 25% różnicy między użytkownikami PPI a osobami niestosującymi dla obu wyników, co daje nam 99% mocy dla obu Celów 2 i 3). Przeprowadzimy również analizy podgrup w ramach grup NW i OB.