Effekten af ​​PPI-terapi på vægt, tarmmikrobiom og udtryk for GPR41 og GPR43

Forskningsplan:

Patienter uden gastrointestinale symptomer, der er planlagt til en screening eller overvågning af koloskopi (for kolorektal cancer) på UCH endoskopi lab vil blive screenet for undersøgelsen baseret på inklusions- og eksklusionskriterierne. Kvalificerede patienter, der giver samtykke til undersøgelsen, vil få målt og registreret højde, vægt og demografiske oplysninger. De vil udfylde et spørgeskema om vægt/diæthistorie. Patienterne vil gennemgå screening/overvågning koloskopi i henhold til rutinemæssig klinisk behandling. Resterende afføring aspireres som standard gennem koloskopet for at sikre fuld visualisering af slimhinden for at forbedre polypdetektion. Vi vil tage afføringsaspirater fra tre separate steder: sigmoid colon, cecum og terminal ileum. Beviser tyder på, at en tarmforberedelse (før koloskopi) ikke ændrer sammensætningen af ​​tarmmikrobiotaen væsentligt for de fleste forsøgspersoner. Vi vil også tage fire små, knivspids biopsier på hver af disse tre steder. Afføringsaspirater og biopsiprøver vil blive lynfrosset i flydende N2 og frosset ved -80C, indtil de kræves til deres analyser.

Vi vil tilmelde i alt 48 forsøgspersoner fordelt ligeligt mellem fire grupper: OB/PPI, OB/ikke-PPI, NW/PPI og NW/ikke-PPI. Cirka 40-50 patienter om ugen, der opfylder ovenstående inklusions-/eksklusionskriterier, gennemgår en screening/overvågningskoloskopi på UCH, hvilket gør rekruttering af 2-3 patienter/uge over 6-9 måneder realistisk for at nå målrettet optagelse.

Mål 1: At undersøge virkningerne af PPI-brug på tarmmikrobiotaen i tyktarmen og terminal ileum hos normalvægtige (NW) og overvægtige (OB) patienter. Intestinale mikrobiomer vil blive profileret ved 16S rRNA-sekventering for at identificere PPI-associerede ændringer i tarmbiodiversiteten.

Separate sterile prøveopsamlingsbeholdere vil blive brugt til afføringsaspirater og slimhindebiopsier fra sigmoid colon, cecum og terminal ileum. High-throughput DNA-sekventering til mikrobiomanalyse vil blive brugt.

Mikrobiom 16S rRNA-profilering Totalt fællesskabsgenomisk DNA vil blive fremstillet ud fra tarmprøver og 16S rRNA-gener PCR amplificeret som tidligere beskrevet. Paired-end, multiplekset sekventering vil blive udført. 10-20 millioner DNA-sekvenser vil blive genereret i en enkelt kørsel og 100.000 rRNA-aflæsninger genereret pr. prøve for at sikre >99% sekvensdækning. Demultiplexing, kvalitetsfiltrering, kimære-fjernelse og sekvensklassificering (ved brug af SINA/Silva) vil følge tidligere publikationer. Lignende sekvenser er grupperet i operationelle taksonomiske enheder (OTU'er) baseret på taksonomi.

Mikrobiomdataanalyse Hovedresultatet er den procentvise relative abundance (PRA) af mikrobielle grupper, og vi antager, at dette vil være forskelligt mellem PPI-brugere og ikke-brugere af syreundertrykkende medicin. Specifikke mikrobielle grupper (arter/slægter/phyla), der adskiller sig mellem eksperimentelle grupper, vil blive identificeret ved hjælp af en ikke-parametrisk todelt statistik.40 Statistiske analyser vil blive vurderet til = 0,05 og p-værdier korrigeret for falsk opdagelsesrate (FDR).41 Resultater vil blive valideret ved artsspecifik QPCR.

Mål 2: At bestemme, om PPI-brug ændrer den relative mængde af tarmbakterielt RNA dedikeret til fermenteringscyklussen hos NW- og OB-individer. Vi vil udføre haglgeværsekventering af bulk-RNA fremstillet ud fra tarmmikrobiomer for at identificere mikrobielle metaboliske veje differentielt udtrykt hos patienter på PPI'er. Afføringsaspirater fra terminal ileum, blindtarm og sigmoid colon vil blive opnået som beskrevet ovenfor.

RNA-isolering og -sekventering Mikrobiel RNA vil blive ekstraheret fra 50 mg fækalaspirater ved hjælp af RiboPure Bacteria-ekstraktionssættet (Life Technologies Inc., USA). Til denne pilot vil vi analysere prøver fra i alt 48 forsøgspersoner fordelt ligeligt mellem fire grupper: OB/PPI, OB/ikke-PPI, NW/PPI og NW/ikke-PPI. Vært og mikrobielt rRNA vil blive fjernet ved hjælp af Ribo-Zero bakterier og Ribo-Zero musesæt (Epicentre, Inc, USA). RNA-prøver vil blive forberedt til sekventering ved hjælp af ScriptSeq v2 RNA-Seq (bakterier) kits (Epicentre, Inc, USA). Sekventering vil blive udført på en Illumina HiSeq2000-platform (UC-Denver Microarray og Genomics Core), som giver høj dækningsdybde. Til kvalitetssikring af reproducerbarhed vil to mRNA-prøver af hver prøve blive samlet og sekventeret. I dette piloteksperiment vil vi generere ~20x106 single-end 150-base læsninger pr. prøve for hvert mikrobielt meta-transkriptom-datasæt.

Metatranskriptomdataanalyse Annotering og optælling af bakterielle transkripter vil blive udført på peptidniveau ved hjælp af BLASTX-søgninger mod de ca. 1800 bakterielle genomsekvenser, der i øjeblikket er tilgængelige i GenBank samt NCBI's ikke-redundante proteindatabase ved hjælp af en E-værdi cutoff på <10- 5,44 Bredt niveau funktionelle forskelle mellem prøver vil blive vurderet ved hjælp af annoteringer genereret gennem COG,47 KEGG48 og RAST/SEED værktøjerne.49, 50 Statistisk analyse af enteriske mikrobielle transkriptomer vil fokusere på identifikation af metaboliske veje, der er differentielt udtrykt mellem grupper.44 Gener med annoteringer af høj kvalitet (E<10-5) vil blive brugt til at konstruere en NxM-matrix af gener (M) af forsøgspersoner (N), der registrerer antallet af sekvenslæsninger, der er kommenteret for et givet gen og emne. En lignende NxM-matrix af genkategorier (M) af individer (N) vil blive konstrueret til at tabulere fordelingen af ​​sekvenslæsninger tildelt funktionelle kategorier. Gener eller genkategorier, der adskiller sig i prævalens eller forekomst mellem behandlingsgrupper, vil blive identificeret af henholdsvis Fisher Exact-testen eller Kruskal-Wallis-testen, der anvendes på hvert gen/kategori i matrixen. Signifikans vil blive vurderet til = 0,05, efter korrektion for FDR.41 vil P-værdier blive brugt til at prioritere en kandidatgenliste til opfølgende validering ved hjælp af QPCR til at screene for genekspression på tværs af hele patientkohorten.

Formål 3: At bestemme i hvilket omfang PPI-brug ændrer ekspression af GPR41, GPR43 og deres effektorgener i colon og terminal ileum hos NW- og OB-patienter. Biopsiprøver vil blive udsat for et panel af RT-QPCR-assays for at overvåge ekspression af målgener påvirket af mikrobiel SCFA-produktion. Biopsier fra terminal ileum, blindtarm og sigmoid colon vil blive opnået som beskrevet ovenfor.

Kvantitativ revers transkriptase-PCR (qRT-PCR) analyse Total RNA vil blive ekstraheret ved hjælp af RNeasy Mini Kit (Qiagen) og ISOGEN (WAKO). Komplementære DNA'er vil blive transskriberet under anvendelse af RNA'er som skabeloner med Moloney murine leukæmivirus revers transkriptase (Invitrogen). cDNA'er vil blive amplificeret ved PCR med Taq DNA polymerase (TaKaRa) under anvendelse af de passende primere. qRT-PCR-analyser vil blive udført ved hjælp af DNA Engine Opticon-2 (MJ Research). Udtrykket vil blive kvantificeret i to eksemplarer.

Prøvestørrelse og effektanalyse:

Vi vil tilmelde 24 NW og 24 fede (OB) deltagere. Halvdelen af ​​NW- og OB-grupperne vil være PPI-brugere og halvdelen vil være ikke-brugere af syreundertrykkende medicin. Det primære resultat for mål 1 er forskellen i PRA for Firmicutes og Bacteroidetes. En tovejs ANOVA (faktorer af BMI-kategori og PPI-brug) vil blive brugt. Baseret på vores foreløbige data vil vi have 94 % kraft til at detektere en forskel i PRA for Firmicutes (72 % vs 52 % med SD på 20 %) og 95 % kraft til at detektere forskelle i PRA for Bacteroidetes (16 % vs 5 % med SD på 5 %) mellem PPI-brugere og ikke-brugere. Det primære resultat for mål 2 er forskellen i bakterielt RNA dedikeret til fermenteringscyklussen, mens resultatet for mål 3 er forskellen i ekspression af GPR 41 og GPR 43. Baseret på de forventede forskelle i tarmmikrobiotaprofilen og efterfølgende SCFA-produktion forventer vi en forskel på 25 % mellem PPI-brugere og ikke-brugere for begge resultater, hvilket giver os 99 % kraft for både mål 2 og 3). Vi vil også udføre undergruppeanalyser indenfor NW og OB grupperne.