从唾液中获取基因组 DNA 的方案设计 (DPOGDNAS)

材料和方法 2.1。 患者 这项研究是在国家理工学院跨学科健康科学中心（圣托马斯科）的牙周诊所对 60 名被诊断患有严重慢性牙周炎的患者进行的。 本研究方案经医学院研究与生物伦理委员会批准。 国家理工学院。 研究中的所有参与者都获得了知情同意书，他们签署了允许收集唾液样本和提取基因组 DNA 的适当表格。 赫尔辛基宣言（1975 年；最近一次更新于 2008 年）确立的人类研究伦理规范得到严格遵守。 指导每位患者如何准备唾液采样，包括至少提前 2 小时刷牙并禁食或饮水。

2.2. 取样品 在一个 50 ml 的试管中放入 10 ml 漱口水（Listerine Cool Mint，Johnson & Johnson，21.6% 酒精）。 指示患者在 30 秒内用该量的漱口水用力漱口，然后将其吐入试管中。 收集后，将样品储存在室温 (20°C - 24°C) 下。 将 60 个样本分为 3 组（n=20），在不同的时间进行 DNA 提取：A 组在 10 天，B 组在 20 天，C 组在 30 天。

2.3. DNA 提取 为了分离漱口水，将试管以 10750x g 离心 10 分钟。 倒出上清液，用 1 ml PBS 洗涤细胞沉淀，在涡流中重悬 30 s，然后转移到新的 2 ml 试管中。 然后以 2000x g 离心 5 分钟，倒出上清液，用 1.5 ml PBS 洗涤沉淀物并在涡流中重新悬浮 30 秒。 向该溶液中加入 1 ml 有核细胞裂解液（Wizard® 基因组 DNA 纯化试剂盒），然后摇动 20 秒，然后在 37°C 下孵育 10 分钟。 添加 300 µl 蛋白沉淀剂溶液（Wizard® 基因组 DNA 纯化试剂盒）后，将混合物置于冰上 5 分钟，然后以 15000x g 离心 3 分钟。 将上清液放入含有 600 µL 冷异丙醇的 1.5 ml 试管中，轻轻匀浆，然后以 15000x 离心 3 分钟。 倒出上清液，将 600 µL 的 70% 乙醇加入新鲜制剂中，在 15000x g 下离心 3 分钟。 倒出上清液，将管在室温下完全干燥。 最后，加入 100 µL 再水化溶液（Wizard® 基因组 DNA 纯化试剂盒），将混合物在 64 °C 下孵育 1 小时，然后将样品储存在 -20 °C 下等待进一步处理。

2.4. DNA 评估 DNA 浓度和纯度的评估是通过使用 ACT-GENE ASP-3700 光谱仪的分光光度法来确定的。 在 260 nm 处评估 DNA 的浓度，同时使用 260/203 和 260/280 的比率估计纯度。 在含 1% TBE（89 mM Tris 硼酸盐、89 mM 硼酸、2 mM EDTA）的 0.8% 琼脂糖凝胶中通过电泳评估基因组 DNA 的完整性，然后用 Gel-Red 显示 DNA 并在紫外光下读取. 从血液样本中提取的 DNA 用作阳性对照。

2.5. PCR PCR 反应是在 Eppendorf Mastercycler® Personal 设备中按照制造商的说明使用 HotStarTaq® Master Mix Qiagen 试剂盒（No. de Cat 203445）进行的。 为了验证提取的 DNA 的质量和物种（人类），针对 rs679620 多态性设计了引物（正向 5´- ggg gCT TAA ggC ACA TgA gT-3；反向 5´- ACT TCg ggA TgC CAg gAA Ag - 3´ ; Tm：56°C，40 个循环），扩增了 485 bp 的产物。 最终的 PCR 产物用 2% 的琼脂糖凝胶进行评估。 从血液样本中提取的 DNA 用作阳性对照。

2.6. 测序 为了进一步验证获得的 DNA 的质量和种类，按照制造商的说明，使用 Applied Biosystems 3130 测序仪和 BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing 试剂盒对 PCR 产生的产物进行测序。 使用 Geneious 版本 7.1.3 分析数据 软件 [23]，使用 NC_000011.10 顺序作为参考。