Разработка протокола получения геномной ДНК из слюны (DPOGDNAS)

Материалы и методы 2.1. Пациенты Исследование было проведено с участием 60 пациентов с диагнозом «тяжелый хронический пародонтит» в пародонтологической клинике Междисциплинарного центра медицинских наук (подразделение Санто-Томас) Национального политехнического института. Протокол этого исследования был одобрен Комитетом по исследованиям и биоэтике Медицинской школы. Национальный политехнический институт. Информированное согласие было получено от всех участников, включенных в исследование, которые подписали соответствующую форму, разрешающую сбор образцов слюны и выделение геномной ДНК. Этические нормы исследования человека, установленные Хельсинкской декларацией (1975 г.; последний раз обновлены в 2008 г.), строго соблюдались. Каждый пациент был проинструктирован, как подготовиться к забору слюны, что включало чистку зубов по крайней мере за 2 часа до этого и воздержание от еды и питья.

2.2. Взятие образца В пробирку объемом 50 мл помещали 10 мл жидкости для полоскания рта (Listerine Cool Mint, Johnson & Johnson, 21,6% спирта). Пациентов инструктировали энергично полоскать рот этим количеством жидкости для полоскания рта в течение 30 с, а затем выплевывать ее в трубку. После сбора образцы хранили при комнатной температуре (20°C - 24°C). 60 образцов были разделены на 3 группы (n=20), и экстракция ДНК проводилась в разное время: группа А через 10 дней, группа В через 20 дней и группа С через 30 дней.

2.3. Выделение ДНК. Для отделения жидкости для полоскания рта пробирку центрифугировали в течение 10 мин при 10750xg. Супернатант сливали, клеточный осадок промывали 1 мл PBS, ресуспендировали в вортексе в течение 30 с и переносили в новую 2-мл пробирку. Затем его центрифугировали в течение 5 мин при 2000xg, сливали надосадочную жидкость, осадок промывали 1,5 мл PBS и ресуспендировали в вортексе в течение 30 с. К этому раствору добавляли 1 мл раствора для лизиса ядерных клеток (набор для очистки геномной ДНК Wizard®) перед встряхиванием в течение 20 с с последующей инкубацией при 37°C в течение 10 мин. После добавления 300 мкл раствора белкового осадителя (набор для очистки геномной ДНК Wizard®) смесь помещали на лед на 5 минут, а затем центрифугировали при 15000×g в течение 3 минут. Супернатант помещали в пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 600 мкл холодного изопропанола, осторожно гомогенизировали, затем центрифугировали при 15000x в течение 3 мин. Супернатант сливали, к свежему препарату добавляли 600 мкл 70% этанола, центрифугировали при 15000 g в течение 3 мин. Супернатант сливали и пробирку полностью сушили при комнатной температуре. Наконец, добавляли 100 мкл раствора для регидратации (набор для очистки геномной ДНК Wizard®) и смесь инкубировали при 64 °C в течение 1 часа перед хранением образцов при -20 °C в ожидании дальнейшей обработки.

2.4. Оценка ДНК. Оценку концентрации и чистоты ДНК определяли спектрофотометрически на спектрометре ACT-GENE ASP-3700. Концентрацию ДНК оценивали при 260 нм, а чистоту оценивали при соотношениях 260/203 и 260/280. Целостность геномной ДНК оценивали в 0,8% агарозном геле в 1% TBE (89 мМ Трисборат, 89 мМ борная кислота, 2 мМ ЭДТА) с помощью электрофореза, а затем ДНК визуализировали с помощью Gel-Red и считывали в УФ-свете. . В качестве положительного контроля использовали ДНК, выделенную из образцов крови.

2.5. ПЦР Реакцию ПЦР проводили в приборе Eppendorf Mastercycler® Personal с использованием набора HotStarTaq® Master Mix Qiagen (№ de Cat 203445) в соответствии с инструкциями производителя. Для проверки качества и вида (человека) выделенной ДНК были разработаны праймеры для полиморфизма rs679620 (прямой 5´-ggg gCT TAA ggC ACA TgA gT-3; обратный 5´-ACT TCg ggA TgC CAg gAA Ag-3´ ; Тпл: 56°С, 40 циклов), которые амплифицируют продукт размером 485 п.н. Конечный продукт ПЦР оценивали с помощью 2% агарозного геля. В качестве положительного контроля использовали ДНК, выделенную из образцов крови.

2.6. Секвенирование Для дальнейшей проверки качества и вида полученной ДНК продукт, полученный в результате ПЦР, секвенировали с помощью секвенатора Applied Biosystems 3130 и набора для циклического секвенирования BigDye® Terminator v3.1, следуя инструкциям производителя. Данные были проанализированы с помощью Geneious версии 7.1.3. программное обеспечение [23], используя NC_000011.10 последовательность в качестве ссылки.