Entwurf eines Protokolls zur Gewinnung genomischer DNA aus Speichel (DPOGDNAS)

Materialien und Methoden 2.1. Patienten Die Studie wurde mit 60 Patienten durchgeführt, bei denen eine schwere chronische Parodontitis in der Parodontologieklinik des Interdisziplinären Zentrums für Gesundheitswissenschaften (Santo Tomás Unit) des Nationalen Polytechnischen Instituts diagnostiziert wurde. Das Protokoll dieser Studie wurde vom Research and Bioethics Committee der School of Medicine genehmigt. Nationales Polytechnisches Institut. Die Einwilligung nach Aufklärung wurde von allen an der Studie beteiligten Teilnehmern eingeholt, die das entsprechende Formular unterzeichneten, das die Entnahme von Speichelproben und die Extraktion genomischer DNA erlaubte. Die in der Deklaration von Helsinki (1975; zuletzt 2008 aktualisiert) festgelegten ethischen Normen für die Forschung am Menschen wurden strikt befolgt. Jeder Patient wurde instruiert, wie er sich auf die Speichelprobe vorbereiten sollte, was darin bestand, sich mindestens 2 Stunden vorher die Zähne zu putzen und nichts zu essen oder zu trinken.

2.2. Entnahme der Probe In ein Röhrchen mit 50 ml wurden 10 ml Mundwasser (Listerine Cool Mint, Johnson & Johnson, 21,6 % Alkohol) gegeben. Die Patienten wurden angewiesen, ihren Mund 30 Sekunden lang kräftig mit dieser Menge Mundwasser zu spülen und sie dann in das Röhrchen zu spucken. Nach der Entnahme wurden die Proben bei Raumtemperatur (20°C–24°C) gelagert. Die 60 Proben wurden in 3 Gruppen (n=20) eingeteilt, und die DNA-Extraktion wurde zu unterschiedlichen Zeiten durchgeführt: Gruppe A nach 10 Tagen, Gruppe B nach 20 Tagen und Gruppe C nach 30 Tagen.

2.3. DNA-Extraktion Um das Mundwasser abzutrennen, wurde das Röhrchen 10 Minuten lang bei 10750 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde abgegossen und das Zellpellet mit 1 ml PBS gewaschen, 30 s im Vortex resuspendiert und in ein neues 2-ml-Röhrchen überführt. Anschließend wurde 5 min bei 2000 x g zentrifugiert, der Überstand abgegossen und das Pellet mit 1,5 ml PBS gewaschen und 30 s im Vortex resuspendiert. Zu dieser Lösung wurde 1 ml Lyselösung von kernhaltigen Zellen (Wizard® Genomic DNA Purification Kit) gegeben, bevor sie 20 Sekunden lang geschüttelt wurde, gefolgt von einer Inkubation bei 37 °C für 10 Minuten. Nach Zugabe von 300 &mgr;l Proteinpräzipitationslösung (Wizard® Genomic DNA Purification Kit) wurde die Mischung 5 min auf Eis gestellt und dann 3 min bei 15000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein 1,5-ml-Röhrchen gegeben, das 600 &mgr;l kaltes Isopropanol enthielt, und sanft homogenisiert, dann bei 15000x für 3 min zentrifugiert. Der Überstand wurde abgegossen und 600 &mgr;l 70%iges Ethanol wurden zu einer frischen Präparation gegeben, die 3 min lang bei 15000 × g zentrifugiert wurde. Der Überstand wurde abgegossen und das Röhrchen bei Raumtemperatur vollständig getrocknet. Schließlich wurden 100 µl Rehydrationslösung (Wizard® Genomic DNA Purification Kit) hinzugefügt und die Mischung wurde bei 64 °C für 1 h inkubiert, bevor die Proben bei -20 °C gelagert wurden, um auf die weitere Verarbeitung zu warten.

2.4. DNA-Bewertung Die Bewertung der Konzentration und Reinheit der DNA wurde durch Spektrophotometrie mit einem ACT-GENE ASP-3700-Spektrometer bestimmt. Die DNA-Konzentration wurde bei 260 nm bewertet, während die Reinheit mit den Verhältnissen 260/203 und 260/280 geschätzt wurde. Die Integrität der genomischen DNA wurde in einem 0,8 % Agarosegel in 1 % TBE (89 mM Tris Borat, 89 mM Borsäure, 2 mM EDTA) durch Elektrophorese bewertet, und dann wurde die DNA mit Gel-Red sichtbar gemacht und unter UV-Licht gelesen . Als positive Kontrolle wurde aus Blutproben extrahierte DNA verwendet.

2.5. PCR Die PCR-Reaktion wurde in einem Eppendorf Mastercycler® Personal Gerät mit dem HotStarTaq® Master Mix Qiagen Kit (No. de Cat 203445) nach Herstellerangaben durchgeführt. Um die Qualität und Art (Mensch) der extrahierten DNA zu überprüfen, wurden Primer für den rs679620-Polymorphismus (vorwärts 5´- ggg gCT TAA ggC ACA TgA gT-3; rückwärts 5´- ACT TCg ggA TgC CAg gAA Ag - 3´ ; Tm: 56°C, 40 Zyklen), die ein Produkt von 485 bp amplifizierten. Das endgültige PCR-Produkt wurde mit einem 2 % Agarosegel bewertet. Aus Blutproben extrahierte DNA wurde als positive Kontrolle verwendet.

2.6. Sequenzierung Um die Qualität und Spezies der erhaltenen DNA weiter zu verifizieren, wurde das aus der PCR resultierende Produkt mit einem Applied Biosystems 3130-Sequenzer und dem BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers sequenziert. Die Daten wurden mit Geneious Version 7.1.3 analysiert Software [23], unter Verwendung der NC_000011.10 Sequenz als Referenz.