Conception d'un protocole d'obtention d'ADN génomique à partir de la salive (DPOGDNAS)

Matériels et méthodes 2.1. Patients L'étude a été menée auprès de 60 patients diagnostiqués avec une parodontite chronique sévère à la Clinique parodontale du Centre interdisciplinaire des sciences de la santé (Unité Santo Tomás), Institut polytechnique national. Le protocole de cette étude a été approuvé par le comité de recherche et de bioéthique de l'École de médecine. Institut National Polytechnique. Un consentement éclairé a été obtenu de tous les participants inclus dans l'étude, qui ont signé le formulaire approprié permettant le prélèvement d'échantillons de salive et l'extraction de l'ADN génomique. Les normes éthiques pour la recherche sur les êtres humains, établies par la Déclaration d'Helsinki (1975 ; mise à jour la plus récente en 2008) ont été strictement suivies. Chaque patient a été informé de la manière de se préparer au prélèvement de salive, qui impliquait de se brosser les dents au moins 2 heures auparavant et de s'abstenir de manger ou de boire quoi que ce soit.

2.2. Prélèvement de l'échantillon Dans un tube de 50 ml ont été placés 10 ml de bain de bouche (Listerine Cool Mint, Johnson & Johnson, 21,6 % d'alcool). Les patients devaient se rincer vigoureusement la bouche avec cette quantité de bain de bouche pendant 30 s, puis la cracher dans le tube. Une fois collectés, les échantillons ont été conservés à température ambiante (20°C - 24°C). Les 60 échantillons ont été répartis en 3 groupes (n=20), et l'extraction d'ADN a été réalisée à des temps distincts : groupe A à 10 jours, groupe B à 20 jours et groupe C à 30 jours.

2.3. Extraction de l'ADN Pour séparer le bain de bouche, le tube a été centrifugé pendant 10 min à 10750x g. Le surnageant a été versé et le culot cellulaire lavé avec 1 ml de PBS, remis en suspension dans le vortex pendant 30 s et transféré dans un nouveau tube de 2 ml. Il a ensuite été centrifugé pendant 5 min à 2000x g, le surnageant a été versé et le culot a été lavé avec 1,5 ml de PBS et remis en suspension dans le vortex pendant 30 s. A cette solution a été ajoutée une solution de 1 ml de lyse de cellules nucléées (Wizard® Genomic DNA Purification Kit) avant d'être agitée pendant 20 s, suivie d'une incubation à 37 ° C pendant 10 min. Après avoir ajouté 300 µl de solution de précipitateur de protéines (Wizard® Genomic DNA Purification Kit), le mélange a été placé sur de la glace pendant 5 min, puis centrifugé à 15 000 x g pendant 3 min. Le surnageant a été placé dans un tube de 1,5 ml contenant 600 µL d'Isopropanol froid et homogénéisé doucement, puis centrifugé à 15000x pendant 3 min. Le surnageant a été versé et 600 µL d'éthanol à 70 % ont été ajoutés à une préparation fraîche, qui a été centrifugée à 15 000 x g pendant 3 min. Le surnageant a été versé et le tube a été complètement séché à température ambiante. Enfin, 100 µL de solution de réhydratation (Wizard® Genomic DNA Purification Kit) ont été ajoutés et le mélange a été incubé à 64 °C pendant 1 h avant de stocker les échantillons à -20 °C en attendant un traitement ultérieur.

2.4. Évaluation de l'ADN L'évaluation de la concentration et de la pureté de l'ADN a été déterminée par spectrophotométrie avec un spectromètre ACT-GENE ASP-3700. La concentration d'ADN a été évaluée à 260 nm, tandis que la pureté a été estimée avec les rapports de 260/203 et 260/280. L'intégrité de l'ADN génomique a été évaluée dans un gel d'agarose à 0,8 % dans du TBE à 1 % (89 mM de Tris Borate, 89 mM d'acide borique, 2 mM d'EDTA) par électrophorèse, puis l'ADN a été visualisé avec du Gel-Red et lu sous lumière UV. . L'ADN extrait des échantillons de sang a été utilisé comme contrôle positif.

2.5. PCR La réaction PCR a été réalisée dans un appareil Eppendorf Mastercycler® Personal avec le kit HotStarTaq® Master Mix Qiagen (No. de Cat 203445), en suivant les instructions du fabricant. Pour vérifier la qualité et l'espèce (humaine) de l'ADN extrait, des amorces ont été conçues pour le polymorphisme rs679620 (forward 5´- ggg gCT TAA ggC ACA TgA gT-3; reverse 5´- ACT TCg ggA TgC CAg gAA Ag - 3´ ; Tm : 56°C, 40 cycles) qui a amplifié un produit de 485 pb. Le produit PCR final a été évalué avec un gel d'agarose à 2 %. L'ADN extrait des échantillons de sang a été utilisé comme contrôle positif.

2.6. Séquençage Pour vérifier davantage la qualité et l'espèce de l'ADN obtenu, le produit résultant de la PCR a été séquencé avec un séquenceur Applied Biosystems 3130 et le kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing, en suivant les instructions du fabricant. Les données ont été analysées avec Geneious version 7.1.3 logiciel [23], utilisant le NC_000011.10 séquence comme référence.