Protokoll tervezése genomiális DNS nyálból való kinyerésére (DPOGDNAS)

Anyagok és módszerek 2.1. Betegek A vizsgálatot 60 súlyos krónikus fogágygyulladással diagnosztizált beteggel végeztük az Országos Politechnikai Intézet Interdiszciplináris Egészségtudományi Központ (Santo Tomás Osztály) Parodontológiai Klinikáján. A vizsgálat protokollját az Orvostudományi Kar Kutatási és Bioetikai Bizottsága hagyta jóvá. Országos Politechnikai Intézet. A vizsgálatban részt vevő összes résztvevőtől tájékozott beleegyezést kaptak, akik aláírták a nyálminták gyűjtését és a genomiális DNS kinyerését lehetővé tevő űrlapot. Szigorúan betartották a Helsinki Nyilatkozat (1975; legutóbb 2008-ban frissített) emberi kutatásra vonatkozó etikai normáit. Minden beteget megtanítottak arra, hogyan készüljenek fel a nyálmintavételre, amely magában foglalta a fogmosást legalább 2 órával korábban, és tartózkodnia kell az evéstől vagy az ivástól.

2.2. Mintavétel Egy 50 ml-es csőbe 10 ml szájvizet helyeztünk (Listerine Cool Mint, Johnson & Johnson, 21,6%-os alkohol). A betegeket arra utasították, hogy 30 másodpercig erőteljesen öblítsék ki a szájukat ezzel a mennyiségű szájvízzel, majd köpjék a csőbe. Az összegyűjtés után a mintákat szobahőmérsékleten (20°C-24°C) tároltuk. A 60 mintát 3 csoportra osztottuk (n=20), és a DNS kivonását különböző időpontokban végeztük: A csoport 10 napon, B csoport 20 napon és C csoport 30 napon belül.

2.3. DNS-kivonás A szájvíz elválasztásához a csövet 10 percig centrifugáltuk 10750xg-vel. A felülúszót kiöntöttük, és a sejtüledéket 1 ml PBS-sel mostuk, 30 másodpercig vortexben szuszpendáltuk, és egy új 2 ml-es csőbe vittük át. Ezután 5 percig centrifugáltuk 2000xg-vel, a felülúszót kiöntöttük, és a pelletet 1,5 ml PBS-sel mostuk, és 30 másodpercig vortexben szuszpendáltuk. Ehhez az oldathoz 1 ml sejtmagvú sejtek lízisoldatát (Wizard® Genomic DNA Purification Kit) adtuk, majd 20 másodpercig ráztuk, majd 37 °C-on 10 percig inkubáltuk. 300 µl fehérje-kicsapó oldat (Wizard® Genomic DNA Purification Kit) hozzáadása után az elegyet jégre helyeztük 5 percre, majd 15000xg-vel 3 percig centrifugáltuk. A felülúszót egy 1,5 ml-es csőbe helyeztük, amely 600 µl hideg izopropanolt tartalmazott, és óvatosan homogenizáltuk, majd 15 000-szeres sebességgel centrifugáltuk 3 percig. A felülúszót kiöntöttük, és 600 µl 70%-os etanolt adtunk egy friss készítményhez, amelyet 15000xg-vel 3 percig centrifugáltunk. A felülúszót kiöntöttük, és a csövet szobahőmérsékleten teljesen megszárítottuk. Végül 100 µl rehidratáló oldatot (Wizard® Genomic DNA Purification Kit) adtunk hozzá, és az elegyet 64 °C-on 1 órán át inkubáltuk, mielőtt a mintákat -20 °C-on tároltuk, hogy megvárjuk a további feldolgozást.

2.4. DNS kiértékelés A DNS koncentrációjának és tisztaságának értékelését spektrofotometriával ACT-GENE ASP-3700 spektrométerrel határoztuk meg. A DNS koncentrációját 260 nm-en, míg a tisztaságot 260/203 és 260/280 arányokkal becsültük. A genomiális DNS integritását 0,8%-os agaróz gélben, 1%-os TBE-ben (89 mM Tris-borát, 89 mM bórsav, 2 mM EDTA) elektroforézissel határoztuk meg, majd a DNS-t Gel-Red segítségével tettük láthatóvá és UV fényben olvastuk le. . Vérmintákból kivont DNS-t használtunk pozitív kontrollként.

2.5. PCR A PCR-reakciót Eppendorf Mastercycler® Personal készülékben, a HotStarTaq® Master Mix Qiagen kittel (Kat. 203445) végeztük, követve a gyártó utasításait. A kivont DNS minőségének és fajtájának (humán) ellenőrzésére primereket terveztünk az rs679620 polimorfizmushoz (előre 5'-ggg gCT TAA ggC ACA TgA gT-3; fordított 5'- ACT TCg ggA TgC CAg gAA Ag - 3' Tm: 56 °C, 40 ciklus), amely 485 bp méretű terméket amplifikált. A PCR végterméket 2%-os agaróz géllel értékeltük ki. Vérmintákból kivont DNS-t használtunk pozitív kontrollként.

2.6. Szekvenálás A kapott DNS minőségének és fajtájának további ellenőrzése érdekében a PCR-ből származó terméket Applied Biosystems 3130 szekvenátorral és BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing kittel szekvenáltuk a gyártó utasításait követve. Az adatokat a Geneious 7.1.3-as verziójával elemeztük szoftver [23], az NC_000011.10 szekvencia referenciaként.