Design af en protokol til opnåelse af genomisk DNA fra spyt (DPOGDNAS)

Materialer og metoder 2.1. Patienter Undersøgelsen blev udført med 60 patienter diagnosticeret med svær kronisk paradentose i den parodontiske klinik på det tværfaglige sundhedsvidenskabelige center (Santo Tomás Unit), National Polytechnic Institute. Protokollen for denne undersøgelse blev godkendt af forsknings- og bioetikkomitéen på School of Medicine. National Polytechnic Institute. Informeret samtykke blev opnået fra alle deltagere inkluderet i undersøgelsen, som underskrev den passende formular, der muliggjorde indsamling af spytprøver og ekstraktion af genomisk DNA. Etiske normer for forskning i mennesker, som er fastsat ved Helsinki-erklæringen (1975; senest opdateret i 2008), blev strengt fulgt. Hver patient blev instrueret i, hvordan de skulle forberede sig til spytprøvetagning, som indebar at børste deres tænder mindst 2 timer før og afholde sig fra at spise eller drikke noget.

2.2. Udtagning af prøven I et rør på 50 ml blev der anbragt 10 ml mundskyl (Listerine Cool Mint, Johnson & Johnson, 21,6% alkohol). Patienterne blev bedt om at skylle munden kraftigt med denne mængde mundskyl i løbet af 30 sek. og derefter spytte det ned i røret. Efter opsamling blev prøverne opbevaret ved stuetemperatur (20°C - 24°C). De 60 prøver blev opdelt i 3 grupper (n=20), og ekstraktion af DNA blev udført på forskellige tidspunkter: gruppe A efter 10 dage, gruppe B efter 20 dage og gruppe C efter 30 dage.

2.3. DNA-ekstraktion For at adskille mundskyllevandet blev røret centrifugeret i 10 minutter ved 10750 x g. Supernatanten blev hældt ud, og den cellulære pellet blev vasket med 1 ml PBS, resuspenderet i hvirvelen i 30 s og overført til et nyt 2 ml rør. Den blev derefter centrifugeret i 5 minutter ved 2000 x g, supernatanten blev hældt ud, og pelleten blev vasket med 1,5 ml PBS og resuspenderet i hvirvelen i 30 s. Til denne opløsning blev der tilsat en 1 ml opløsning af lysis af kerneholdige celler (Wizard® Genomic DNA Purification Kit), før den blev rystet i 20 s, efterfulgt af inkubation ved 37 °C i 10 min. Efter tilsætning af 300 µl proteinpræcipitatoropløsning (Wizard® Genomic DNA Purification Kit) blev blandingen anbragt på is i 5 minutter og derefter centrifugeret ved 15000 x g i 3 minutter. Supernatanten blev anbragt i et 1,5 ml rør indeholdende 600 µL kold isopropanol og homogeniseret forsigtigt, derefter centrifugeret ved 15000x i 3 minutter. Supernatanten blev hældt ud, og 600 µL 70% ethanol blev tilsat til et frisk præparat, som blev centrifugeret ved 15000 x g i 3 minutter. Supernatanten blev hældt ud, og røret blev fuldstændig tørret ved stuetemperatur. Til sidst blev 100 µL rehydreringsopløsning (Wizard® Genomic DNA Purification Kit) tilsat, og blandingen blev inkuberet ved 64 °C i 1 time, før prøverne blev opbevaret ved -20 °C for at afvente yderligere behandling.

2.4. DNA-evaluering Evaluering af koncentrationen og renheden af ​​DNA blev bestemt ved spektrofotometri med et ACT-GENE ASP-3700 spektrometer. Koncentrationen af ​​DNA blev vurderet ved 260 nm, mens renhed blev estimeret med forholdet 260/203 og 260/280. Integriteten af ​​genomisk DNA blev vurderet i en 0,8% agarosegel i 1% TBE (89 mM Tris Borat, 89 mM borsyre, 2 mM EDTA) ved elektroforese, og derefter blev DNA'et visualiseret med Gel-Red og aflæst under UV-lys . DNA ekstraheret fra blodprøver blev brugt som den positive kontrol.

2.5. PCR PCR-reaktionen blev udført i et Eppendorf Mastercycler® Personal-apparat med HotStarTaq® Master Mix Qiagen kit (nr. de Cat 203445), efter producentens instruktioner. For at verificere kvaliteten og arten (human) af det ekstraherede DNA, blev primere designet til rs679620 polymorfien (fremad 5´- ggg gCT TAA ggC ACA TgA gT-3; omvendt 5´- ACT TCg ggA TgC CAg gAA Ag - 3´ Tm: 56°C, 40 cyklusser), der amplificerede et produkt på 485 bp. Det endelige PCR-produkt blev evalueret med en 2% agarosegel. DNA ekstraheret fra blodprøver blev brugt som en positiv kontrol.

2.6. Sekventering For yderligere at verificere kvaliteten og arten af ​​det opnåede DNA, blev produktet, der stammede fra PCR, sekventeret med en Applied Biosystems 3130-sekventeringsenhed og BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing-sættet efter producentens instruktioner. Data blev analyseret med Geneious version 7.1.3 software [23], ved hjælp af NC_000011.10 sekvens som reference.