Ontwerp van een protocol voor het verkrijgen van genomisch DNA uit speeksel (DPOGDNAS)

Materialen en methoden 2.1. Patiënten De studie werd uitgevoerd met 60 patiënten met de diagnose ernstige chronische parodontitis in de Parodontologische Kliniek van het Interdisciplinair Centrum voor Gezondheidswetenschappen (Santo Tomás Unit), Nationaal Polytechnisch Instituut. Het protocol van deze studie werd goedgekeurd door de Research and Bioethics Committee van de School of Medicine. Nationaal Polytechnisch Instituut. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle deelnemers aan het onderzoek, die het juiste formulier ondertekenden voor het verzamelen van speekselmonsters en de extractie van genomisch DNA. De ethische normen voor onderzoek op mensen, vastgelegd in de Verklaring van Helsinki (1975; voor het laatst bijgewerkt in 2008), werden strikt gevolgd. Elke patiënt werd geïnstrueerd hoe hij zich moest voorbereiden op speekselafname, wat inhield dat hij minstens 2 uur van tevoren zijn tanden moest poetsen en niets mocht eten of drinken.

2.2. Monstername In een tube van 50 ml werd 10 ml mondspoeling gedaan (Listerine Cool Mint, Johnson & Johnson, 21,6% alcohol). Patiënten kregen de instructie om gedurende 30 s hun mond krachtig te spoelen met deze hoeveelheid mondwater en het daarna in de tube te spugen. Eenmaal verzameld werden de monsters bewaard bij kamertemperatuur (20°C - 24°C). De 60 monsters werden verdeeld in 3 groepen (n=20) en de extractie van DNA werd op verschillende tijdstippen uitgevoerd: groep A na 10 dagen, groep B na 20 dagen en groep C na 30 dagen.

2.3. DNA-extractie Om de mondspoeling te scheiden, werd de buis gedurende 10 minuten bij 10750 x g gecentrifugeerd. Het supernatant werd uitgegoten en de cellulaire pellet werd gewassen met 1 ml PBS, opnieuw gesuspendeerd in de vortex gedurende 30 seconden en overgebracht naar een nieuwe buis van 2 ml. Het werd vervolgens gedurende 5 minuten bij 2000 x g gecentrifugeerd, het supernatant werd uitgegoten en de pellet werd gewassen met 1,5 ml PBS en opnieuw gesuspendeerd in de vortex gedurende 30 seconden. Aan deze oplossing werd een 1 ml oplossing van lysis van kernhoudende cellen (Wizard® Genomic DNA Purification Kit) toegevoegd alvorens gedurende 20 seconden te worden geschud, gevolgd door incubatie bij 37 °C gedurende 10 minuten. Na toevoeging van 300 µl eiwitprecipitatoroplossing (Wizard® Genomic DNA Purification Kit), werd het mengsel gedurende 5 minuten op ijs geplaatst en vervolgens gedurende 3 minuten bij 15.000 x g gecentrifugeerd. Het supernatant werd in een buis van 1,5 ml met 600 µl koude isopropanol gedaan en voorzichtig gehomogeniseerd en vervolgens gedurende 3 minuten bij 15.000x gecentrifugeerd. Het supernatant werd uitgegoten en 600 µl 70% ethanol werd toegevoegd aan een vers preparaat, dat gedurende 3 minuten bij 15.000 x g werd gecentrifugeerd. Het supernatant werd uitgegoten en de buis werd volledig gedroogd bij kamertemperatuur. Ten slotte werd 100 µl rehydratatieoplossing (Wizard® Genomic DNA Purification Kit) toegevoegd en het mengsel werd gedurende 1 uur bij 64 °C geïncubeerd voordat de monsters bij -20 °C werden opgeslagen in afwachting van verdere verwerking.

2.4. DNA-evaluatie Evaluatie van de concentratie en zuiverheid van DNA werd bepaald door spectrofotometrie met een ACT-GENE ASP-3700 spectrometer. De concentratie van DNA werd geëvalueerd bij 260 nm, terwijl de zuiverheid werd geschat met de verhoudingen van 260/203 en 260/280. De integriteit van genomisch DNA werd beoordeeld in een 0,8% agarosegel in 1% TBE (89 mM Tris Boraat, 89 mM boorzuur, 2 mM EDTA) door middel van elektroforese, en vervolgens werd het DNA gevisualiseerd met Gel-Red en afgelezen onder UV-licht . DNA geëxtraheerd uit bloedmonsters werd gebruikt als de positieve controle.

2.5. PCR De PCR-reactie werd uitgevoerd in een Eppendorf Mastercycler® Personal apparaat met de HotStarTaq® Master Mix Qiagen kit (Nr. de Cat 203445), volgens de instructies van de fabrikant. Om de kwaliteit en soort (humaan) van het geëxtraheerde DNA te verifiëren, werden primers ontworpen voor het rs679620-polymorfisme (forward 5'- ggg gCT TAA ggC ACA TgA gT-3; reverse 5'- ACT TCg ggA TgC CAg gAA Ag - 3' Tm: 56°C, 40 cycli) die een product van 485 bp amplificeerden. Het uiteindelijke PCR-product werd geëvalueerd met een 2% agarosegel. DNA geëxtraheerd uit bloedmonsters werd gebruikt als een positieve controle.

2.6. Sequentiebepaling Om de kwaliteit en soort van het verkregen DNA verder te verifiëren, werd de sequentie van het product dat het resultaat was van PCR bepaald met een Applied Biosystems 3130-sequencer en de BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing-kit, volgens de instructies van de fabrikant. Gegevens werden geanalyseerd met Geneious versie 7.1.3 software [23], met behulp van de NC_000011.10 volgorde als referentie.