Design av ett protokoll för att erhålla genomiskt DNA från saliv (DPOGDNAS)

Material och metoder 2.1. Patienter Studien genomfördes med 60 patienter diagnostiserade med svår kronisk parodontit i parodontologiska kliniken vid Interdisciplinary Health Sciences Center (Santo Tomás Unit), National Polytechnic Institute. Protokollet för denna studie godkändes av forsknings- och bioetikkommittén vid School of Medicine. National Polytechnic Institute. Informerat samtycke erhölls från alla deltagare som ingick i studien, som undertecknade det lämpliga formuläret som möjliggör insamling av salivprover och extraktion av genomiskt DNA. Etiska normer för forskning om människor, fastställda genom Helsingforsdeklarationen (1975; uppdaterad senast 2008), följdes strikt. Varje patient fick instruktioner om hur de skulle förbereda sig för salivprovtagning, vilket innebar att de borstade tänderna minst 2 timmar tidigare och att de avstod från att äta eller dricka någonting.

2.2. Ta provet I ett rör på 50 ml placerades 10 ml munvatten (Listerine Cool Mint, Johnson & Johnson, 21,6% alkohol). Patienterna instruerades att skölja munnen kraftigt med denna mängd munvatten under 30 s och sedan spotta den i röret. När proverna väl samlats in lagrades de vid rumstemperatur (20°C - 24°C). De 60 proverna delades in i 3 grupper (n=20), och extraktionen av DNA utfördes vid olika tidpunkter: grupp A efter 10 dagar, grupp B efter 20 dagar och grupp C efter 30 dagar.

2.3. DNA-extraktion För att separera munvatten centrifugerades röret under 10 minuter vid 10750xg. Supernatanten hälldes ut och den cellulära pelleten tvättades med 1 ml PBS, återsuspenderades i virveln under 30 s och överfördes till ett nytt 2 ml rör. Den centrifugerades sedan i 5 minuter vid 2000 x g, supernatanten hälldes ut och pelleten tvättades med 1,5 ml PBS och återsuspenderades i virveln under 30 s. Till denna lösning sattes en 1 ml lösning av lys av kärnförsedda celler (Wizard® Genomic DNA Purification Kit) innan den skakades i 20 sekunder, följt av inkubation vid 37 °C i 10 minuter. Efter tillsats av 300 µl proteinutfällningslösning (Wizard® Genomic DNA Purification Kit), placerades blandningen på is i 5 minuter och centrifugerades sedan vid 15 000 x g under 3 minuter. Supernatanten placerades i ett 1,5 ml rör innehållande 600 µL kall isopropanol och homogeniserades försiktigt, centrifugerades sedan vid 15000x under 3 min. Supernatanten hälldes ut och 600 µL 70 % etanol sattes till ett nytt preparat, som centrifugerades vid 15 000 x g under 3 min. Supernatanten hälldes ut och röret torkades fullständigt vid rumstemperatur. Slutligen tillsattes 100 µL rehydreringslösning (Wizard® Genomic DNA Purification Kit) och blandningen inkuberades vid 64 °C i 1 timme innan proverna lagrades vid -20 °C för att invänta ytterligare bearbetning.

2.4. DNA-utvärdering Utvärdering av koncentrationen och renheten hos DNA bestämdes genom spektrofotometri med en ACT-GENE ASP-3700-spektrometer. Koncentrationen av DNA utvärderades vid 260 nm, medan renheten uppskattades med förhållandena 260/203 och 260/280. Integriteten hos genomiskt DNA bedömdes i en 0,8 % agarosgel i 1 % TBE (89 mM Tris Borat, 89 mM borsyra, 2 mM EDTA) genom elektrofores, och sedan visualiserades DNA:t med Gel-Red och avlästes under UV-ljus . DNA extraherat från blodprover användes som positiv kontroll.

2.5. PCR PCR-reaktionen utfördes i en Eppendorf Mastercycler® Personal-apparat med HotStarTaq® Master Mix Qiagen-kit (nr. de Cat 203445), enligt tillverkarens instruktioner. För att verifiera kvaliteten och arten (human) av det extraherade DNA:t designades primrar för rs679620 polymorfism (framåt 5´- ggg gCT TAA ggC ACA TgA gT-3; omvänd 5´- ACT TCg ggA TgC CAg gAA Ag - 3´ Tm: 56°C, 40 cykler) som amplifierade en produkt på 485 bp. Den slutliga PCR-produkten utvärderades med en 2% agarosgel. DNA extraherat från blodprover användes som en positiv kontroll.

2.6. Sekvensering För att ytterligare verifiera kvaliteten och arten av det erhållna DNA:t sekvenserades produkten från PCR med en Applied Biosystems 3130-sekvenserare och BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing-kit, enligt tillverkarens instruktioner. Data analyserades med Geneious version 7.1.3 programvara [23], med hjälp av NC_000011.10 sekvens som referens.