Návrh protokolu pro získání genomové DNA ze slin (DPOGDNAS)

Materiály a metody 2.1. Pacienti Studie byla provedena s 60 pacienty s diagnostikovanou závažnou chronickou parodontitidou na Parodontické klinice Interdisciplinárního centra zdravotnických věd (jednotka Santo Tomás), Národní polytechnický institut. Protokol této studie byl schválen Výborem pro výzkum a bioetiku Lékařské fakulty. Národní polytechnický institut. Informovaný souhlas byl získán od všech účastníků zahrnutých do studie, kteří podepsali příslušný formulář umožňující odběr vzorků slin a extrakci genomové DNA. Etické normy pro výzkum na lidských bytostech stanovené Helsinskou deklarací (1975; naposledy aktualizovány v roce 2008) byly přísně dodržovány. Každý pacient byl instruován, jak se připravit na odběr slin, což zahrnovalo čištění zubů alespoň 2 hodiny předem a zdržení se čehokoli jíst a pít.

2.2. Odebírání vzorku Do zkumavky o objemu 50 ml bylo umístěno 10 ml ústní vody (Listerine Cool Mint, Johnson & Johnson, 21,6% alkohol). Pacienti byli instruováni, aby si tímto množstvím ústní vody během 30 s důkladně vyplachovali ústa a poté ji vyplivli do zkumavky. Jakmile byly vzorky odebrány, byly uloženy při teplotě místnosti (20 °C - 24 °C). 60 vzorků bylo rozděleno do 3 skupin (n=20) a extrakce DNA byla provedena v různých časech: skupina A po 10 dnech, skupina B po 20 dnech a skupina C po 30 dnech.

2.3. Extrakce DNA Pro oddělení ústní vody byla zkumavka centrifugována po dobu 10 minut při 10 750 x g. Supernatant byl vylit a buněčná peleta promyta 1 ml PBS, resuspendována ve vortexu po dobu 30 s a přenesena do nové 2 ml zkumavky. Poté byla centrifugována po dobu 5 minut při 2000 x g, supernatant byl vylit a peleta promyta 1,5 ml PBS a resuspendována ve vortexu po dobu 30 sekund. K tomuto roztoku byl přidán 1 ml roztoku lýzy jaderných buněk (Wizard® Genomic DNA Purification Kit) před protřepáváním po dobu 20 s, poté následovala inkubace při 37 °C po dobu 10 minut. Po přidání 300 ul roztoku proteinového precipitátoru (Wizard® Genomic DNA Purification Kit) byla směs umístěna na led na 5 minut a poté centrifugována při 15000x g po dobu 3 minut. Supernatant byl vložen do 1,5 ml zkumavky obsahující 600 ul studeného isopropanolu a jemně homogenizován, poté centrifugován při 15000x po dobu 3 minut. Supernatant byl vylit a 600 ul 70% ethanolu bylo přidáno k čerstvému ​​přípravku, který byl centrifugován při 15 000 x g po dobu 3 minut. Supernatant byl vylit a zkumavka byla zcela vysušena při teplotě místnosti. Nakonec bylo přidáno 100 ul rehydratačního roztoku (Wizard® Genomic DNA Purification Kit) a směs byla inkubována při 64 °C po dobu 1 hodiny před uložením vzorků při -20 °C, aby se čekalo na další zpracování.

2.4. Hodnocení DNA Hodnocení koncentrace a čistoty DNA bylo stanoveno spektrofotometrií se spektrometrem ACT-GENE ASP-3700. Koncentrace DNA byla hodnocena při 260 nm, zatímco čistota byla odhadnuta s poměry 260/203 a 260/280. Integrita genomové DNA byla hodnocena v 0,8% agarózovém gelu v 1% TBE (89 mM Tris borát, 89 mM kyselina boritá, 2 mM EDTA) elektroforézou a poté byla DNA vizualizována pomocí Gel-Red a odečtena pod UV světlem. . DNA extrahovaná z krevních vzorků byla použita jako pozitivní kontrola.

2.5. PCR Reakce PCR byla provedena v přístroji Eppendorf Mastercycler® Personal se soupravou HotStarTaq® Master Mix Qiagen (č. de Cat 203445), podle pokynů výrobce. Pro ověření kvality a druhu (lidské) extrahované DNA byly navrženy primery pro polymorfismus rs679620 (dopředný 5´- ggg gCT TAA ggC ACA TgA gT-3; reverzní 5´- ACT TCg ggA TgC CAg gAA Ag - 3´ Tm: 56 °C, 40 cyklů), které amplifikovaly produkt 485 bp. Konečný produkt PCR byl hodnocen pomocí 2% agarózového gelu. DNA extrahovaná z krevních vzorků byla použita jako pozitivní kontrola.

2.6. Sekvenování Pro další ověření kvality a druhu získané DNA byl produkt získaný z PCR sekvenován pomocí sekvenátoru Applied Biosystems 3130 a soupravy BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit podle pokynů výrobce. Data byla analyzována pomocí Geneious verze 7.1.3 software [23] pomocí NC_000011.10 sekvence jako reference.