Progettazione di un protocollo per ottenere DNA genomico dalla saliva (DPOGDNAS)

Materiali e metodi 2.1. Pazienti Lo studio è stato condotto su 60 pazienti con diagnosi di parodontite cronica grave presso la Clinica parodontale del Centro interdisciplinare di scienze della salute (Unità di Santo Tomás), Istituto Politecnico nazionale. Il protocollo di questo studio è stato approvato dal Comitato di Ricerca e Bioetica della Scuola di Medicina. Istituto Politecnico Nazionale. Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i partecipanti inclusi nello studio, che hanno firmato l'apposito modulo che consente la raccolta di campioni di saliva e l'estrazione del DNA genomico. Le norme etiche per la ricerca sugli esseri umani, stabilite dalla Dichiarazione di Helsinki (1975; aggiornata da ultimo nel 2008), sono state rigorosamente seguite. Ogni paziente è stato istruito su come prepararsi per il campionamento della saliva, che prevedeva di lavarsi i denti almeno 2 ore prima e di astenersi dal mangiare o dal bere qualsiasi cosa.

2.2. Prelievo del campione In un tubo da 50 ml sono stati posti 10 ml di collutorio (Listerine Cool Mint, Johnson & Johnson, 21,6% di alcol). I pazienti sono stati istruiti a sciacquarsi vigorosamente la bocca con questa quantità di collutorio per 30 secondi, quindi sputarlo nel tubo. Una volta raccolti, i campioni sono stati conservati a temperatura ambiente (20°C - 24°C). I 60 campioni sono stati divisi in 3 gruppi (n=20), e l'estrazione del DNA è stata effettuata in tempi distinti: gruppo A a 10 giorni, gruppo B a 20 giorni e gruppo C a 30 giorni.

2.3. Estrazione del DNA Per separare il collutorio, la provetta è stata centrifugata per 10 minuti a 10750x g. Il surnatante è stato versato e il pellet cellulare lavato con 1 ml di PBS, risospeso nel vortice per 30 secondi e trasferito in una nuova provetta da 2 ml. È stato quindi centrifugato per 5 minuti a 2000 x g, il surnatante è stato versato e il pellet lavato con 1,5 ml di PBS e risospeso nel vortex per 30 s. A questa soluzione è stata aggiunta una soluzione da 1 ml di lisi di cellule nucleate (Wizard® Genomic DNA Purification Kit) prima di essere agitata per 20 s, seguita da incubazione a 37 °C per 10 min. Dopo aver aggiunto 300 µl di soluzione di precipitatore proteico (Wizard® Genomic DNA Purification Kit), la miscela è stata posta in ghiaccio per 5 min e poi centrifugata a 15000xg per 3 min. Il surnatante è stato posto in una provetta da 1,5 ml contenente 600 µL di isopropanolo freddo e omogeneizzato delicatamente, quindi centrifugato a 15000x per 3 min. Il surnatante è stato versato e 600 µL di etanolo al 70% sono stati aggiunti a una preparazione fresca, che è stata centrifugata a 15000 x g per 3 min. Il surnatante è stato versato e la provetta è stata completamente asciugata a temperatura ambiente. Infine, sono stati aggiunti 100 µL di soluzione di reidratazione (Wizard® Genomic DNA Purification Kit) e la miscela è stata incubata a 64 °C per 1 ora prima di conservare i campioni a -20 °C in attesa di un'ulteriore elaborazione.

2.4. Valutazione del DNA La valutazione della concentrazione e della purezza del DNA è stata determinata mediante spettrofotometria con uno spettrometro ACT-GENE ASP-3700. La concentrazione del DNA è stata valutata a 260 nm, mentre la purezza è stata stimata con i rapporti di 260/203 e 260/280. L'integrità del DNA genomico è stata valutata in un gel di agarosio allo 0,8% in TBE all'1% (89 mM Tris Borate, 89 mM acido borico, 2 mM EDTA) mediante elettroforesi, quindi il DNA è stato visualizzato con Gel-Red e letto sotto luce UV . Il DNA estratto dai campioni di sangue è stato utilizzato come controllo positivo.

2.5. PCR La reazione PCR è stata eseguita in un apparecchio Eppendorf Mastercycler® Personal con il kit HotStarTaq ® Master Mix Qiagen (n. de Cat 203445), seguendo le istruzioni del produttore. Per verificare la qualità e la specie (umana) del DNA estratto, sono stati disegnati primer per il polimorfismo rs679620 (forward 5´- ggg gCT TAA ggC ACA TgA gT-3; reverse 5´- ACT TCg ggA TgC CAg gAA Ag - 3´ ; Tm: 56°C, 40 cicli) che amplificava un prodotto di 485 bp. Il prodotto PCR finale è stato valutato con un gel di agarosio al 2%. Il DNA estratto dai campioni di sangue è stato utilizzato come controllo positivo.

2.6. Sequenziamento Per verificare ulteriormente la qualità e le specie del DNA ottenuto, il prodotto risultante dalla PCR è stato sequenziato con un sequenziatore Applied Biosystems 3130 e il kit di sequenziamento del ciclo BigDye® Terminator v3.1, seguendo le istruzioni del produttore. I dati sono stati analizzati con Geneious versione 7.1.3 software [23], utilizzando il NC_000011.10 sequenza come riferimento.