Design av en protokoll for å oppnå genomisk DNA fra spytt (DPOGDNAS)

Materialer og metoder 2.1. Pasienter Studien ble utført med 60 pasienter diagnostisert med alvorlig kronisk periodontitt i Periodontic Clinic ved Interdisciplinary Health Sciences Center (Santo Tomás Unit), National Polytechnic Institute. Protokollen for denne studien ble godkjent av forsknings- og bioetikkkomiteen ved School of Medicine. Nasjonalt polyteknisk institutt. Informert samtykke ble innhentet fra alle deltakerne inkludert i studien, som signerte det passende skjemaet som muliggjorde innsamling av spyttprøver og ekstraksjon av genomisk DNA. Etiske normer for forskning på mennesker, fastsatt ved Helsinki-erklæringen (1975; oppdatert senest i 2008) ble strengt fulgt. Hver pasient ble instruert i hvordan de skulle forberede seg til spyttprøvetaking, som innebar å pusse tennene sine minst 2 timer tidligere og avstå fra å spise eller drikke noe som helst.

2.2. Ta prøven I et rør på 50 ml ble det plassert 10 ml munnvann (Listerine Cool Mint, Johnson & Johnson, 21,6 % alkohol). Pasientene ble bedt om å skylle munnen kraftig med denne mengden munnvann i løpet av 30 s, og deretter spytte den inn i røret. Når prøvene var samlet ble de lagret ved romtemperatur (20°C - 24°C). De 60 prøvene ble delt inn i 3 grupper (n=20), og ekstraksjonen av DNA ble utført til distinkte tider: gruppe A etter 10 dager, gruppe B etter 20 dager og gruppe C etter 30 dager.

2.3. DNA-ekstraksjon For å skille munnvannet ble røret sentrifugert i løpet av 10 minutter ved 10750xg. Supernatanten ble helt ut og den cellulære pelleten vasket med 1 ml PBS, resuspendert i virvelen i 30 s og overført til et nytt 2 ml rør. Den ble deretter sentrifugert i 5 minutter ved 2000 x g, supernatanten helt ut, og pelleten vasket med 1,5 ml PBS og resuspendert i virvelen i 30 s. Til denne løsningen ble det tilsatt en 1 ml løsning av lysis av kjerneholdige celler (Wizard® Genomic DNA Purification Kit) før den ble ristet i 20 sekunder, etterfulgt av inkubering ved 37 °C i 10 minutter. Etter tilsetning av 300 µl proteinutfellingsløsning (Wizard® Genomic DNA Purification Kit), ble blandingen plassert på is i 5 minutter og deretter sentrifugert ved 15000x g i 3 minutter. Supernatanten ble satt i et 1,5 ml rør inneholdende 600 ul kald isopropanol og homogenisert forsiktig, deretter sentrifugert ved 15000x i 3 minutter. Supernatanten ble helt ut og 600 ul 70% etanol ble tilsatt til et ferskt preparat som ble sentrifugert ved 15000 x g i 3 minutter. Supernatanten ble helt ut og røret ble fullstendig tørket ved romtemperatur. Til slutt ble 100 µL rehydreringsløsning (Wizard® Genomic DNA Purification Kit) tilsatt og blandingen ble inkubert ved 64 °C i 1 time før prøvene ble lagret ved -20 °C for å avvente videre behandling.

2.4. DNA-evaluering Evaluering av konsentrasjonen og renheten til DNA ble bestemt ved spektrofotometri med et ACT-GENE ASP-3700 spektrometer. Konsentrasjonen av DNA ble evaluert ved 260 nm, mens renheten ble estimert med forholdene 260/203 og 260/280. Integriteten til genomisk DNA ble vurdert i en 0,8 % agarosegel i 1 % TBE (89 mM Tris Borat, 89 mM borsyre, 2 mM EDTA) ved elektroforese, og deretter ble DNA visualisert med Gel-Red og lest under UV-lys . DNA ekstrahert fra blodprøver ble brukt som positiv kontroll.

2.5. PCR PCR-reaksjonen ble utført i et Eppendorf Mastercycler® Personal-apparat med HotStarTaq® Master Mix Qiagen-settet (nr. de Cat 203445), etter produsentens instruksjoner. For å verifisere kvaliteten og arten (menneskelig) til det ekstraherte DNA, ble primere designet for rs679620 polymorfisme (forover 5´- ggg gCT TAA ggC ACA TgA gT-3; omvendt 5´- ACT TCg ggA TgC CAg gAA Ag - 3´ Tm: 56°C, 40 sykluser) som amplifiserte et produkt på 485 bp. Det endelige PCR-produktet ble evaluert med en 2% agarosegel. DNA ekstrahert fra blodprøver ble brukt som en positiv kontroll.

2.6. Sekvensering For ytterligere å verifisere kvaliteten og arten til DNA som ble oppnådd, ble produktet som ble resultatet av PCR sekvensert med en Applied Biosystems 3130-sekvenser og BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing-settet, i henhold til produsentens instruksjoner. Data ble analysert med Geneious versjon 7.1.3 programvare [23], ved å bruke NC_000011.10 sekvens som referanse.