Projekt protokołu pozyskiwania genomowego DNA ze śliny (DPOGDNAS)

Materiały i metody 2.1. Pacjenci Badanie przeprowadzono z udziałem 60 pacjentów z rozpoznaniem ciężkiego przewlekłego zapalenia przyzębia w Klinice Periodontologii Interdyscyplinarnego Centrum Nauk o Zdrowiu (Santo Tomás Unit) Narodowego Instytutu Politechnicznego. Protokół tego badania został zatwierdzony przez Komisję ds. Badań i Bioetyki Szkoły Medycznej. Narodowy Instytut Politechniczny. Świadomą zgodę uzyskano od wszystkich uczestników włączonych do badania, którzy podpisali odpowiedni formularz zezwalający na pobranie próbek śliny i ekstrakcję genomowego DNA. Ściśle przestrzegano norm etycznych dotyczących badań na ludziach, ustanowionych w Deklaracji Helsińskiej (1975; ostatnio zaktualizowanej w 2008 r.). Każdy pacjent został poinstruowany, jak przygotować się do pobrania śliny, co polegało na umyciu zębów co najmniej 2 godziny wcześniej oraz powstrzymaniu się od jedzenia i picia czegokolwiek.

2.2. Pobieranie próbki W probówce o pojemności 50 ml umieszczono 10 ml płynu do płukania jamy ustnej (Listerine Cool Mint, Johnson & Johnson, 21,6% alkoholu). Pacjenci zostali poinstruowani, aby energicznie płukać usta taką ilością płynu do płukania jamy ustnej przez 30 s, a następnie wypluwać go do rurki. Po pobraniu próbki przechowywano w temperaturze pokojowej (20°C - 24°C). 60 próbek podzielono na 3 grupy (n=20) i przeprowadzono ekstrakcję DNA w różnym czasie: grupa A po 10 dniach, grupa B po 20 dniach i grupa C po 30 dniach.

2.3. Ekstrakcja DNA W celu oddzielenia płynu do płukania ust probówkę wirowano przez 10 minut przy 10750 x g. Supernatant wylano, a osad komórkowy przemyto 1 ml PBS, ponownie zawieszono w wirze na 30 s i przeniesiono do nowej probówki o pojemności 2 ml. Następnie wirowano ją przez 5 minut przy 2000 x g, supernatant wylano, a osad przemyto 1,5 ml PBS i ponownie zawieszono w wirze przez 30 sekund. Do tego roztworu dodano 1 ml roztworu do lizy komórek jądrzastych (zestaw Wizard® Genomic DNA Purification Kit) przed wytrząsaniem przez 20 s, a następnie inkubowano w temperaturze 37°C przez 10 min. Po dodaniu 300 µl roztworu do wytrącania białek (zestaw do oczyszczania DNA genomowego Wizard®), mieszaninę umieszczono na lodzie na 5 min, a następnie wirowano przy 15000 x g przez 3 min. Supernatant umieszczono w 1,5 ml probówce zawierającej 600 µl zimnego izopropanolu i delikatnie homogenizowano, następnie wirowano przy 15000x przez 3 minuty. Supernatant wylano i do świeżego preparatu dodano 600 µl 70% etanolu, który wirowano przy 15000 x g przez 3 minuty. Supernatant wylano i probówkę całkowicie wysuszono w temperaturze pokojowej. Na koniec dodano 100 µl roztworu do ponownego nawodnienia (zestaw do oczyszczania DNA genomowego Wizard®) i mieszaninę inkubowano w temperaturze 64°C przez 1 godzinę przed przechowywaniem próbek w temperaturze -20°C w oczekiwaniu na dalsze przetwarzanie.

2.4. Ocena DNA Ocenę stężenia i czystości DNA przeprowadzono metodą spektrofotometryczną na spektrometrze ACT-GENE ASP-3700. Stężenie DNA oceniano przy 260 nm, natomiast czystość oceniano przy stosunkach 260/203 i 260/280. Integralność genomowego DNA oceniano w 0,8% żelu agarozowym w 1% TBE (89 mM Tris boran, 89 mM kwas borowy, 2 mM EDTA) za pomocą elektroforezy, a następnie DNA wizualizowano za pomocą Gel-Red i odczytywano w świetle UV . Jako kontrolę pozytywną zastosowano DNA wyekstrahowane z próbek krwi.

2.5. PCR Reakcję PCR przeprowadzono w aparacie Eppendorf Mastercycler® Personal z zestawem HotStarTaq® Master Mix Qiagen (nr kat. 203445), zgodnie z instrukcjami producenta. Aby zweryfikować jakość i gatunek (ludzki) wyekstrahowanego DNA, zaprojektowano startery dla polimorfizmu rs679620 (do przodu 5´- ggg gCT TAA ggC ACA TgA gT-3; do tyłu 5´- ACT TCg ggA TgC CAg gAA Ag - 3´ ; Tm: 56°C, 40 cykli), które zamplifikowały produkt o 485 bp. Końcowy produkt PCR oceniano za pomocą 2% żelu agarozowego. DNA wyekstrahowane z próbek krwi zastosowano jako kontrolę pozytywną.

2.6. Sekwencjonowanie W celu dalszej weryfikacji jakości i gatunku otrzymanego DNA, produkt uzyskany w reakcji PCR zsekwencjonowano za pomocą sekwenatora Applied Biosystems 3130 i zestawu BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing, zgodnie z instrukcjami producenta. Dane analizowano za pomocą Geneious w wersji 7.1.3 oprogramowanie [23], używając NC_000011.10 sekwencja jako odniesienie.