Protokollan suunnittelu genomisen DNA:n saamiseksi syljestä (DPOGDNAS)

Materiaalit ja menetelmät 2.1. Potilaat Tutkimus suoritettiin 60 potilaalla, joilla oli diagnosoitu vaikea krooninen parodontiitti Kansallisen ammattikorkeakoulun monitieteisen terveystieteen keskuksen (Santo Tomásin yksikkö) periodonttisessa klinikalla. Tämän tutkimuksen protokollan hyväksyi lääketieteellisen korkeakoulun tutkimus- ja bioetiikkakomitea. Kansallinen ammattikorkeakoulu. Tietoinen suostumus saatiin kaikilta tutkimukseen osallistuneilta, jotka allekirjoittivat asianmukaisen lomakkeen, joka salli sylkinäytteiden keräämisen ja genomisen DNA:n erottamisen. Helsingin julistuksella (1975; viimeksi päivitetty 2008) vahvistettuja ihmistutkimuksen eettisiä normeja noudatettiin tiukasti. Jokaiselle potilaalle opastettiin valmistautumaan sylkinäytteenottoon, joka sisälsi hampaiden harjauksen vähintään 2 tuntia aikaisemmin ja pidättäytymisestä syömästä tai juomasta mitään.

2.2. Näytteen ottaminen 50 ml:n putkeen laitettiin 10 ml suuvettä (Listerine Cool Mint, Johnson & Johnson, 21,6 % alkoholia). Potilaita ohjeistettiin huuhtelemaan suunsa voimakkaasti tällä määrällä suuvettä 30 sekunnin ajan ja sylkemään se sitten putkeen. Keräyksen jälkeen näytteet säilytettiin huoneenlämpötilassa (20 °C - 24 °C). 60 näytettä jaettiin 3 ryhmään (n = 20), ja DNA:n uuttaminen suoritettiin eri aikoina: ryhmä A 10 päivän kohdalla, ryhmä B 20 päivän kohdalla ja ryhmä C 30 päivän kohdalla.

2.3. DNA-uutto Suuveden erottamiseksi putkea sentrifugoitiin 10 minuutin ajan 10 750 x g:ssä. Supernatantti kaadettiin ja solupelletti pestiin 1 ml:lla PBS:ää, suspendoitiin uudelleen pyörteeseen 30 sekunnin ajan ja siirrettiin uuteen 2 ml:n putkeen. Sitten sitä sentrifugoitiin 5 minuuttia 2 000 x g:llä, supernatantti kaadettiin pois ja pelletti pestiin 1,5 ml:lla PBS:ää ja suspendoitiin uudelleen pyörteeseen 30 sekunnin ajan. Tähän liuokseen lisättiin 1 ml tumallisten solujen lyysiliuosta (Wizard® Genomic DNA Purification Kit) ennen kuin sitä ravisteltiin 20 sekuntia, minkä jälkeen inkuboitiin 37 °C:ssa 10 minuuttia. Kun oli lisätty 300 ui proteiinisaostusliuosta (Wizard® Genomic DNA Purification Kit), seos asetettiin jäille 5 minuutiksi ja sitten sentrifugoitiin 15 000 x g:llä 3 minuuttia. Supernatantti laitettiin 1,5 ml:n putkeen, joka sisälsi 600 ui kylmää isopropanolia, ja homogenisoitiin varovasti, sitten sentrifugoitiin 15 000x 3 minuuttia. Supernatantti kaadettiin ja 600 ui 70-prosenttista etanolia lisättiin tuoreeseen valmisteeseen, jota sentrifugoitiin 15 000 x g:llä 3 minuuttia. Supernatantti kaadettiin pois ja putki kuivattiin täysin huoneenlämpötilassa. Lopuksi lisättiin 100 ui rehydraatioliuosta (Wizard® Genomic DNA Purification Kit) ja seosta inkuboitiin 64 °C:ssa 1 tunti ennen kuin näytteitä säilytettiin -20 °C:ssa jatkokäsittelyn odottamiseksi.

2.4. DNA:n arviointi DNA:n pitoisuuden ja puhtauden arviointi määritettiin spektrofotometrialla ACT-GENE ASP-3700 -spektrometrillä. DNA:n konsentraatio arvioitiin aallonpituudella 260 nm, kun taas puhtaus arvioitiin suhteilla 260/203 ja 260/280. Genomisen DNA:n eheys arvioitiin 0,8-prosenttisessa agaroosigeelissä 1-prosenttisessa TBE:ssä (89 mM Tris-boraatti, 89 mM boorihappo, 2 mM EDTA) elektroforeesilla, minkä jälkeen DNA visualisoitiin Gel-Redillä ja luettiin UV-valossa. . Positiivisena kontrollina käytettiin verinäytteistä uutettua DNA:ta.

2.5. PCR PCR-reaktio suoritettiin Eppendorf Mastercycler® Personal -laitteessa HotStarTaq® Master Mix Qiagen -sarjan (nro. Cat 203445) kanssa valmistajan ohjeita noudattaen. Uutetun DNA:n laadun ja lajin (ihmis) varmistamiseksi suunniteltiin alukkeet rs679620-polymorfismille (eteenpäin 5´-ggg gCT TAA ggC ACA TgA gT-3; käänteinen 5´- ACT TCg ggA TgC CAg gAA Ag - 3´ Tm: 56 °C, 40 sykliä), joka monisti 485 bp:n tuotteen. Lopullinen PCR-tuote arvioitiin 2-prosenttisella agaroosigeelillä. Verinäytteistä uutettua DNA:ta käytettiin positiivisena kontrollina.

2.6. Sekvensointi Saadun DNA:n laadun ja lajin tarkistamiseksi edelleen PCR:stä saatu tuote sekvensoitiin Applied Biosystems 3130 -sekvensoijalla ja BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing -sarjalla valmistajan ohjeita noudattaen. Tiedot analysoitiin Geneious-versiolla 7.1.3 ohjelmisto [23] käyttämällä tiedostoa NC_000011.10 sekvenssi viitteenä.