타액에서 게놈 DNA를 얻기 위한 프로토콜 설계 (DPOGDNAS)

재료 및 방법 2.1. 환자 이 연구는 National Polytechnic Institute, Interdisciplinary Health Sciences Center(Santo Tomás Unit)의 Periodontic Clinic에서 중증 만성 치주염 진단을 받은 60명의 환자를 대상으로 수행되었습니다. 이 연구의 프로토콜은 의과 대학 연구 및 생명 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 국립 폴리테크닉 연구소. 타액 샘플 수집 및 게놈 DNA 추출을 허용하는 적절한 양식에 서명한 연구에 포함된 모든 참가자로부터 사전 동의를 얻었습니다. 헬싱키 선언(1975년, 가장 최근 업데이트는 2008년)에 의해 제정된 인간 연구에 대한 윤리적 규범을 엄격히 준수했습니다. 각 환자는 적어도 2시간 전에 양치질을 하고 아무것도 먹거나 마시지 않는 타액 샘플링을 준비하는 방법을 지시받았습니다.

2.2. 샘플 채취 50ml 튜브에 10ml 구강청결제(Listerine Cool Mint, Johnson & Johnson, 21.6% 알코올)를 넣었습니다. 환자는 30초 동안 이 양의 구강청결제로 입을 세게 헹구고 튜브에 뱉도록 지시받았다. 수집된 샘플은 실온(20°C - 24°C)에서 보관되었습니다. 60개의 샘플을 3개의 그룹(n=20)으로 나누고 DNA 추출을 각각 다른 시간에 수행하였다: 그룹 A는 10일, 그룹 B는 20일, 그룹 C는 30일이었다.

2.3. DNA 추출 구강청결제를 분리하기 위해 튜브를 10750x g에서 10분 동안 원심분리했습니다. 상청액을 붓고 세포 펠릿을 1ml의 PBS로 세척하고 30초 동안 소용돌이에 재현탁하고 새로운 2ml 튜브로 옮겼습니다. 그런 다음 2000xg에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 붓고 펠릿을 1.5ml의 PBS로 세척하고 30초 동안 소용돌이에 재현탁했습니다. 이 용액에 유핵 세포 용해 용액(Wizard® Genomic DNA Purification Kit) 1ml를 첨가한 후 20초 동안 진탕한 다음 37°C에서 10분 동안 배양했습니다. 300 µl의 protein precipitator solution(Wizard® Genomic DNA Purification Kit)을 첨가한 후 혼합물을 5분 동안 얼음에 놓고 15000x g에서 3분 동안 원심 분리했습니다. 상등액을 600 μL의 차가운 이소프로판올이 들어 있는 1.5 ml 튜브에 넣고 부드럽게 균질화한 다음 15000x에서 3분 동안 원심분리했습니다. 상등액을 따라내고 600 μL의 70% 에탄올을 신선한 제제에 첨가하고 15000x g에서 3분 동안 원심분리하였다. 상등액을 따라내고 튜브를 실온에서 완전히 건조시켰다. 마지막으로, 100µL의 재수화 용액(Wizard® Genomic DNA Purification Kit)을 추가하고 혼합물을 64°C에서 1시간 동안 배양한 후 추가 처리를 위해 샘플을 -20°C에 보관했습니다.

2.4. DNA 평가 DNA의 농도 및 순도 평가는 ACT-GENE ASP-3700 분광계를 사용하여 분광광도법으로 측정했습니다. DNA의 농도는 260 nm에서 평가되었으며 순도는 260/203과 260/280의 비율로 평가되었습니다. 게놈 DNA의 무결성은 전기 영동에 의해 1% TBE(89mM Tris Borate, 89mM 붕산, 2mM EDTA)의 0.8% 아가로스 젤에서 평가한 다음 DNA를 Gel-Red로 시각화하고 UV 조명 아래에서 읽었습니다. . 혈액 샘플에서 추출한 DNA를 양성 대조군으로 사용하였다.

2.5. PCR PCR 반응은 제조업체의 지침에 따라 HotStarTaq® Master Mix Qiagen 키트(No. de Cat 203445)가 있는 Eppendorf Mastercycler® 개인용 장치에서 수행되었습니다. 추출된 DNA의 품질과 종(인간)을 확인하기 위해 rs679620 다형성(forward 5´-ggg gCT TAA ggC ACA TgA gT-3; reverse 5´- ACT TCg ggA TgC CAg gAA Ag - 3´에 대한 프라이머를 설계했습니다. ; Tm: 56℃, 40 사이클) 485bp의 곱을 증폭시켰다. 최종 PCR 생성물은 2% 아가로스 겔로 평가하였다. 혈액 샘플에서 추출한 DNA를 양성 대조군으로 사용했습니다.

2.6. 시퀀싱 획득한 DNA의 품질과 종을 추가로 확인하기 위해 제조업체의 지침에 따라 PCR 결과 산물을 Applied Biosystems 3130 시퀀서 및 BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing 키트로 시퀀싱했습니다. 데이터는 Geneious 버전 7.1.3으로 분석되었습니다. 소프트웨어 [23], NC_000011.10 사용 참조로 시퀀스.