一项比较短期卵母细胞与精子接触与标准孵育对体外受精治疗活产率影响的研究

1. 背景

   体外受精（IVF）技术现在普遍用于治疗不育夫妇。 为了获得更好的体外受精结果，通过优化体外受精技术来提高胚胎质量非常重要。 在 IVF 程序中，卵母细胞和精子通常共同孵育过夜，这可能会使卵母细胞和受精卵暴露于次优的培养条件下，并且精子在这种长期培养中产生的活性氧 (ROS) 会增加 [1]。 高水平的活性氧 (ROS) 会对胚胎质量产生不利影响，导致透明带硬化并损害胚胎的着床能力 [2-4]。 研究表明，配子相遇后 20 分钟，哺乳动物卵母细胞成功受精 [5]。 精子可以在15分钟内穿透卵丘细胞，80%的卵母细胞在1小时内接触到大量精子就可以受精[1]。 为了避免长期暴露于精子对卵母细胞可能产生的不利影响，制定了简短的共同孵育授精方案。 这意味着卵母细胞和精子的长期共孵育可能没有必要，甚至可能有害。 一些报告表明，精子-卵母细胞暴露时间为 1-6 小时可改善 IVF 结果[1,2,6,7]，但是，其他研究报告称授精时间较短并没有这种优势[8,9,10]。

   最近发表的 Meta 分析显示 [11] 短暂的配子共同孵化与显着更高的临床妊娠率相关（RR：1.84，95% CI：1.24-2.73）， 持续妊娠 (RR: 1.73, 95%CI: 1.27-2.33) 和更高的着床率 (RR: 1.80, 95% CI: 1.43-2.26) 比标准授精。 但正常受精率（RR：0.98，95% CI：0.93-1.02）， 优质胚胎 (RR: 1.24, 95% CI: 1.0-1.53​​) 和多精症 (RR: 0.84, 95% CI: 0.7-1.01) 与标准授精相比没有显着差异。 在另一项 Cochrane 荟萃分析[12] 中纳入了 8 项随机对照试验，共 733 名女性，得到了相似的结果。 但它只报告了临床妊娠率，持续妊娠率在短暂共孵育组中显着高于标准授精。 对于流产率，一项试验中有 6 次流产，包括 167 名女性。 这种低质量的证据表明，短暂共同孵化和标准授精之间的流产几率没有显着差异（OR 1.98，95% CI 0.35 至 11.09；P = 0.44）。 并且纳入研究中未报告活产，尚不清楚与标准过夜授精方案相比，短暂共同孵育是否能提高活产率。

   这些研究质量固有的缺点，例如缺乏分配隐藏和无盲法，限制了现有证据的质量。 为了更好地评估这些问题，需要更多设计良好的随机对照试验来评估与标准的隔夜授精方案相比，短暂的共同孵化是否有助于提高活产率和降低流产率。

2. 目标：

   本随机、双盲对照研究的目的是比较在接受 IVF 治疗的女性中，与标准孵化相比，更短的卵母细胞暴露于精子的临床效果（尤其是活产率）。

3. 试验设计：

共有 280 名接受 IVF 治疗的不孕妇女将通过计算机生成的随机数随机分配到以下两组中的一组，这些随机数放在密封的信封中：

卵母细胞与精子接触时间较短组：卵母细胞与精子接触 2 小时 标准孵育组：卵母细胞与精子接触 20 小时

受试者的治疗

包括卵巢刺激在内的所有 IVF 技术都将根据当地规程进行。

4.1 卵巢刺激和体外受精

所有女性都使用长激动剂或拮抗剂方案开始卵巢刺激的 IVF 治疗。 对于长期方案，将给予促性腺激素释放激素类似物（GnRHa）进行垂体脱敏，在月经周期的第2-3天进行经阴道超声检查和血清E2测量。 根据中心的标准操作程序，根据窦卵泡计数、女性年龄和既往卵巢反应情况，开始使用人绝经期促性腺激素（hMG）或重组FSH，剂量为每天150-300 IU。 在有或没有激素监测的情况下，通过连续经阴道扫描监测卵巢反应。 进一步的剂量调整将基于卵巢反应，由主管临床医生酌情决定。 对于拮抗剂方案，拮抗剂（cetritide0.25mg 每天）将在卵巢刺激的第 6 天给予，直到 hcg 启动日。

当三个前导卵泡≥18 mm时，将给予hCG 10 000 IU或ovidrel 250 mg以触发卵母细胞的最终成熟。 约36小时后将安排取卵。

4.2 授精程序

所有精液样品均通过常规上游程序制备。 在取卵后 2 小时，每个成熟的卵母细胞将接受大约 50,000-100,000 个活动精子的授精。

4.3.分配和屏蔽

在 OPU 当天，实验室技术人员根据计算机生成的密封信封中的随机化列表，在提取 occyte 后将患者随机分配到较短的孵育组或对照组。 在整个研究完成之前，患者和临床医生都对分配的组不知情。

Control arm 分配到control arm的女性，所有的卵母细胞都会暴露在精子中20小时，并在第1天（20小时）去核后检查是否受精

干预组 对于分配到干预组的那些，所有卵母细胞将暴露于精子 2 小时，并通过两个含有 1.5 ml 平衡培养基的器官培养皿轻轻洗涤，然后转移到相应的平衡新鲜培养基微滴中。 周围的卵丘细胞将被保留，而不是从卵细胞中移除。

4.4 受精和胚胎评估 两组卵母细胞都将被装饰并检查是否存在两个原核和两个极体以确认受精。 还记录了所有其他结果（即没有受精、一个原核、多精症、退化）。

胚胎形态将在培养的每一天进行评估。 将根据以下标准对胚胎进行评分。 简而言之，胚胎被分类为：A级，无细胞碎片； B 级，<20% 碎裂； C 级，20% 至 50% 碎裂；和 D 级，>50% 碎裂。 还记录了每个胚胎的卵裂球数量。 A级和B级胚胎构成“优质胚胎”。

移植由团队临床医生执行，在经腹超声引导下，根据标准方案最多更换 2 个胚胎。 黄体期支持由医生决定。

4.5跟进策略：

双臂胚胎移植后 2 周将进行妊娠试验。 所有在新鲜胚胎移植后 2 周妊娠试验呈阳性的女性将在 5 周后接受经阴道超声扫描，以确定是否存在带有胎心的妊娠囊，这表明正在怀孕。

将收集所有妊娠结局的数据，包括流产或异位妊娠等早期流产。

为了在收集结果方面保持一致，将为每个中心的每位妇女填写标准化病例报告表 (CRF)。 这些 CRF 将包括有关接受治疗、妊娠结果、妊娠并发症、分娩方式和分娩结果的详细信息。

统计数据

5.1 分析计划：作为基线数据收集的一部分收集的人口统计学因素和临床特征将总结为分类变量的计数（百分比）、正态分布连续变量的平均值（标准差 [SD]）或中位数（四分位数 [IQR] 或整个范围）对于其他连续变量。

参与者的结果将在他们被分配到的组中进行分析，无论是否偏离协议或接受治疗（意向治疗）。比较统计分析将需要计算主要结果的相对风险 (RR) (95% CI)（所有二分次要结果的 99% CI）、正态分布的连续次要结果的平均差（99% CI）或中位数偏态连续变量的差异 (99% CI)。

所有分析都将针对最小化因素进行调整，以说明通过平衡随机化引入的治疗组之间的相关性（这迫使治疗组之间的结果与任何治疗效果相似）。

调整后的风险比率将使用对数二项式回归模型进行估计，或者如果二项式模型无法收敛，则使用具有稳健方差估计器的对数泊松回归模型进行估计。 线性回归将用于正态分布的结果，分位数回归用于偏态连续变量。

预先指定的亚组分析将包括卵裂与囊胚阶段转移。

6. 样本量估计：

2010-2012 年，我们中心的平均活产率为每次转移 30%。 根据最近发表的 Meta 分析[11]，配子的短暂共孵化与显着更高的持续妊娠率相关（RR：1.73，95%CI：1.27-2.33） 比标准授精。

假设治疗组活产率=50%（增加70%）；以 90% 的功效和双侧 5% 的统计显着性水平，我们需要在每只手臂中招募 124 名女性。 为了弥补 10% 的失访，我们将在每组中招募 140 名受试者或在整个研究中招募 280 名受试者。

七、安全评估

最近发表的 Meta 分析结果[11,12] 显示，与标准授精相比，短时间配子孵化的正常受精率、优质胚胎和多精子率没有显着差异。 因此，本研究中不应存在重大安全问题。

8.直接访问源数据/文档：

允许进行与试验相关的监测、审计、IRB 审查和监管检查。

9.质量控制和质量保证

患者将由在管理辅助生殖治疗方面具有足够经验的所列研究人员进行管理。 将成立一个试验指导委员会，负责监督试验的进行。

10. 伦理

将获得所有患者的书面同意。 随附英文和中文的患者信息表和同意书。 将获得上海市第一妇婴保健院机构审查委员会的伦理批准。

11. 数据处理和记录保存

所有数据将保存三年。 指定的研究护士将负责数据管理，包括数据编码、监控和验证。

12. 金融保险

该研究将由默克雪兰诺中国生育专家研究基金资助。

13. 出版政策

这项研究的结果将提交给同行评审的科学期刊以供考虑发表。

14. 补充剂

该研究将按照赫尔辛基宣言和临床试验质量管理规范 (ICH-GCP) 进行