Um estudo comparando uma exposição mais curta de oócitos a espermatozóides versus uma incubação padrão na taxa de nascidos vivos do tratamento de fertilização in vitro

1. Fundo

   Atualmente, a técnica de fertilização in vitro (FIV) é comumente usada para o tratamento de casais inférteis. Para obter melhores resultados de fertilização in vitro, é importante melhorar a qualidade do embrião otimizando as técnicas de fertilização in vitro. Em procedimentos de fertilização in vitro, oócitos e espermatozóides são rotineiramente co-incubados durante a noite, o que pode expor oócitos e zigotos a condições de cultura abaixo do ideal com aumento de espécies reativas de oxigênio (ROS) produzidas por espermatozóides nesta cultura de longo prazo [1]. Altos níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS) podem afetar adversamente a qualidade dos embriões, resultar no endurecimento da zona pelúcida e prejudicar a capacidade de implantação dos embriões [2-4]. Estudos mostram que a fertilização bem-sucedida de um oócito mamário ocorre 20 minutos após o encontro dos gametas [5]. O esperma pode penetrar através das células cumulus em 15 minutos, e 80% dos oócitos podem ser fertilizados quando expostos a um grande número de espermatozóides em 1 hora [1]. Como tentativa de evitar possíveis efeitos deletérios sobre os ovócitos decorrentes da longa exposição ao esperma, foi desenvolvido o protocolo de co-incubação breve de inseminação. Isso implica que a co-incubação a longo prazo de oócitos e espermatozóides pode não ser necessária e pode até ser prejudicial. Alguns relatórios sugerem que um tempo de exposição espermatozóide de 1-6 h melhora os resultados da fertilização in vitro [1,2,6,7] No entanto, outros estudos não relatam essa vantagem com um tempo de inseminação curto [8,9,10] .

   Meta análise recente publicada mostra [11] que a co-incubação breve de gametas foi associada a taxas significativamente mais altas de gravidez clínica (RR: 1,84, 95% CI: 1,24-2,73), gravidez em andamento (RR: 1,73, IC 95%: 1,27-2,33) e maior taxa de implantação (RR: 1,80, 95% CI: 1,43-2,26) do que a inseminação padrão. Mas as taxas de fertilização normal (RR: 0,98, IC 95%: 0,93-1,02), embriões de boa qualidade (RR: 1,24, 95% CI: 1,0-1,53) e polispermia (RR: 0,84, 95% CI: 0,7-1,01) não foram significativamente diferentes em comparação com a inseminação padrão. Em outra meta-análise Cochrane[12], oito ECRs com 733 mulheres foram incluídos e obtiveram resultados semelhantes. Mas apenas relatou a taxa de gravidez clínica, a taxa de gravidez contínua que foi significativamente maior no grupo de co-incubação breve do que na inseminação padrão. Para a taxa de aborto espontâneo, houve seis abortos espontâneos em um estudo, incluindo 167 mulheres. Esta evidência de baixa qualidade não sugeriu nenhuma diferença significativa nas chances de aborto espontâneo entre co-incubação breve e inseminação padrão (OR 1,98, 95% CI 0,35 a 11,09; P = 0,44). E nascidos vivos não foram relatados nos estudos incluídos, não está claro se a co-incubação breve melhora a taxa de natalidade em comparação com o protocolo padrão de inseminação noturna.

   Desvantagens inerentes à qualidade desses estudos, como falta de ocultação de alocação e não-cegamento, limitam a qualidade da evidência disponível. Para avaliar melhor essas questões, RCTs mais bem desenhados são necessários para avaliar se a co-incubação breve contribuiria para uma maior taxa de nascidos vivos e uma menor taxa de aborto espontâneo em comparação com o protocolo padrão de inseminação noturna.

2. Objetivos.

   O objetivo do presente estudo randomizado, duplo-cego controlado é comparar a eficácia clínica (especialmente na taxa de nascidos vivos) de uma exposição mais curta do oócito aos espermatozóides em comparação com uma incubação padrão em mulheres submetidas a tratamento de fertilização in vitro.

3. Projeto de teste:

Um total de 280 mulheres inférteis submetidas a tratamento de fertilização in vitro serão randomizadas em um dos dois grupos a seguir por números aleatórios gerados por computador que foram colocados em envelopes lacrados:

Grupo de exposição mais curta do oócito ao espermatozóide: oócito será exposto ao espermatozóide por 2 horas Grupo de incubação padrão: oócito será exposto ao espermatozóide por 20 horas

Tratamento de assuntos

Todas as técnicas de fertilização in vitro, incluindo estimulação ovariana, serão de acordo com os protocolos locais.

4.1 Estimulação ovariana e fertilização in vitro

Todas as mulheres iniciaram o tratamento de fertilização in vitro com estimulação ovariana usando os protocolos de agonista longo ou antagonista. Para protocolo longo, análogo do hormônio liberador de gonadotropina (GnRHa) será administrado para dessensibilização da hipófise, no dia 2-3 do ciclo menstrual, elas serão submetidas a exame de ultrassom transvaginal e medição sérica de E2. A gonadotrofina menopáusica humana (hMG) ou FSH recombinante será iniciada em 150-300 UI por dia com base na contagem de folículos antrais, idade da mulher e resposta ovariana anterior, de acordo com os procedimentos operacionais padrão do centro. A resposta ovariana foi monitorada por varredura transvaginal seriada com ou sem monitoramento hormonal. Outros ajustes de dosagem serão baseados na resposta ovariana, a critério dos médicos responsáveis. Para protocolos antagonistas, antagonista (cetritide0,25mg diariamente) será administrado no 6º dia de estimulação ovariana até o dia do priming de hcg.

Quando três folículos principais tiverem ≥18 mm, hCG 10.000 UI ou ovidrel 250 mg serão administrados para desencadear a maturação final dos oócitos. As recuperações de oócitos serão marcadas cerca de 36 horas depois.

4.2 Procedimentos de Inseminação

Todas as amostras de sêmen foram preparadas pelo procedimento swim-up convencional. Duas horas após a coleta do oócito, cada oócito maturado será inseminado com aproximadamente 50.000-100.000 espermatozóides móveis.

4.3. Atribuição e mascaramento

No dia da OPU, os pacientes serão randomizados após coleta de ocócitos por um técnico de laboratório de acordo com uma lista de randomização gerada por computador em envelopes lacrados para o grupo de incubação mais curto ou o grupo de controle. Até a conclusão de todo o estudo, tanto os pacientes quanto os médicos desconheciam o grupo designado.

Braço controle As mulheres alocadas no braço controle, todos os oócitos serão expostos a espermatozóides por 20 horas e verificados quanto à fertilização no dia 1 (20 horas) após a desnudação

Braço de intervenção Para aqueles alocados no braço de intervenção, todos os oócitos serão expostos a espermatozóides por 2 horas e lavados suavemente através de duas placas de órgãos contendo 1,5 ml de meio equilibrado e, em seguida, transferidos para a microgotícula correspondente de meio fresco equilibrado. As células cumulus circundantes serão mantidas, não removidas dos oócitos.

4.4 Fertilização e Avaliação do Embrião Ambos os grupos de ovócitos serão decoronados e verificados quanto à presença de dois pronúcleos e dois corpúsculos polares para confirmação da fertilização. Todos os outros resultados (ou seja, sem fertilização, um pró-núcleo, polispermia, degeneração) também foram registrados.

A morfologia do embrião será avaliada a cada dia de cultivo. Os embriões serão pontuados de acordo com os seguintes critérios. Resumidamente, os embriões são classificados como: grau A, sem fragmentação celular; grau B, fragmentação <20%; grau C, 20% a 50% de fragmentação; e grau D, >50% de fragmentação. O número de blastômeros por embrião também foi registrado. Os embriões de grau A e B constituíram o "embrião de boa qualidade".

A transferência é realizada pelo clínico da equipe com no máximo 2 embriões sendo substituídos de acordo com o protocolo padrão sob orientação de ultrassom transabdominal. O suporte da fase lútea é dado a critério do médico.

4.5 Estratégia de acompanhamento:

Um teste de gravidez será realizado 2 semanas após a transferência do embrião em ambos os braços. Todas as mulheres que tiverem um teste de gravidez positivo 2 semanas após a transferência de um embrião fresco serão submetidas a uma ultrassonografia transvaginal após mais 5 semanas para identificar a presença de um saco gestacional com um coração fetal, significando uma gravidez em andamento.

Serão coletados dados sobre todos os resultados da gravidez, incluindo perdas precoces da gravidez, como aborto espontâneo ou gravidez ectópica.

A fim de obter consistência com relação à coleta de resultados, formulários padronizados de relato de caso (CRF) serão preenchidos para cada mulher em cada centro. Esses CRFs incluirão detalhes sobre o tratamento recebido, resultados da gravidez, complicações na gravidez, tipo de parto e resultados do nascimento.

Estatisticas

5.1 Plano de análise: Fatores demográficos e características clínicas coletados como parte da coleta de dados de linha de base serão resumidos com contagens (porcentagens) para variáveis ​​categóricas, média (desvio padrão [DP]) para variáveis ​​contínuas normalmente distribuídas ou mediana (interquartil [IQR] ou intervalo inteiro) para outras variáveis ​​contínuas.

Os resultados dos participantes serão analisados ​​nos grupos aos quais são designados, independentemente do desvio do protocolo ou do tratamento recebido (intenção de tratar). A análise estatística comparativa implicará o cálculo do risco relativo (RR) (95% CI) para o resultado primário (99% CIs para todos os resultados secundários dicotômicos), a diferença média (99% CI) para resultados secundários contínuos normalmente distribuídos ou a mediana diferença (IC 99%) para variáveis ​​contínuas assimétricas.

Todas as análises serão ajustadas para os fatores de minimização para contabilizar a correlação entre os grupos de tratamento introduzida pelo equilíbrio da randomização (que força os resultados entre os braços de tratamento a serem semelhantes, independentemente de qualquer efeito do tratamento).

As razões de risco ajustadas serão estimadas usando um modelo de regressão log binomial, ou usando um modelo de regressão log Poisson com um estimador de variância robusto se o modelo binomial não convergir. A regressão linear será usada para resultados normalmente distribuídos e a regressão quantílica para variáveis ​​contínuas distorcidas.

As análises de subgrupo pré-especificadas incluirão a transferência do estágio de clivagem versus blastocisto.

6. Estimativa do tamanho da amostra:

A taxa média de nascidos vivos em nosso centro de 2010 a 2012 foi de 30% por transferência. De acordo com a recente meta-análise publicada [11], a co-incubação breve de gametas foi associada a taxas significativamente mais altas de gravidez contínua (RR: 1,73, 95% CI: 1,27-2,33) do que a inseminação padrão.

Considerando nascidos vivos no grupo de tratamento =50% (aumento de 70%); com poder de 90% e nível de significância estatística bilateral de 5%, precisaremos recrutar 124 mulheres em cada braço. Para contabilizar 10% de perda de acompanhamento, recrutaremos 140 indivíduos em cada grupo ou 280 indivíduos para todo o estudo.

7. Avaliação de segurança

Recults de meta-análise publicada recentemente [11,12] mostraram que as taxas de fertilização normal, embriões de boa qualidade e polispermia não foram significativamente diferentes com a incubação de gametas em um curto período de tempo em comparação com a inseminação padrão. Assim, não deve haver grande preocupação de segurança neste estudo.

8. Acesso direto aos dados/documentos de origem:

São permitidos monitoramento, auditorias, revisão IRB e inspeções regulatórias relacionados a testes.

9. Controle de qualidade e garantia de qualidade

Os pacientes serão gerenciados pelos investigadores listados que têm experiência adequada no gerenciamento de tratamentos de reprodução assistida. Será formado um comitê diretor do julgamento que supervisionará a condução do julgamento.

10. Ética

O consentimento por escrito será obtido de todos os pacientes. A folha de informações do paciente e os formulários de consentimento em inglês e chinês estão incluídos. A aprovação ética será obtida do Conselho de Revisão Institucional, Primeiro Hospital de Maternidade e Saúde Infantil de Xangai.

11. Tratamento de dados e manutenção de registros

Todos os dados serão armazenados por três anos. Uma enfermeira de pesquisa designada será responsável pelo gerenciamento de dados, incluindo codificação, monitoramento e verificação de dados.

12. Financiamento e seguro

O estudo será financiado pelo MerckSerono China Research Fund for Fertility Experts.

13. Política de publicação

Os resultados deste estudo serão submetidos à consideração para publicação em revista científica revisada por pares.

14. Suplementos

O estudo será conduzido em conformidade com a Declaração de Helsinque e Boas Práticas Clínicas (ICH-GCP)