Studie srovnávající kratší expozici oocytů spermiím oproti standardní inkubaci na živé porodnosti při léčbě in vitro fertilizací

1. Pozadí

   Technika in vitro fertilizace (IVF) se nyní běžně používá k léčbě neplodných párů. Pro dosažení lepších výsledků IVF je důležité zlepšit kvalitu embrya optimalizací technik IVF. V postupech IVF jsou oocyty a spermie běžně koinkubovány přes noc, což může vystavit oocyty a zygoty suboptimálním kultivačním podmínkám se zvýšenými reaktivními formami kyslíku (ROS) produkovanými spermiemi v této dlouhodobé kultuře[1]. Vysoké hladiny reaktivních forem kyslíku (ROS) mohou nepříznivě ovlivnit kvalitu embryí, vést ke ztvrdnutí zona pellucida a zhoršit implantační kapacitu embryí [2–4]. Studie ukazují, že k úspěšnému oplodnění savčího oocytu dochází 20 minut po setkání gamet [5]. Spermie mohou proniknout přes buňky kumulu během 15 minut a 80 % oocytů může být oplodněno, pokud jsou vystaveny velkému počtu spermií během 1 hodiny[1]. Ve snaze vyhnout se možným škodlivým účinkům na oocyty při dlouhé expozici spermatu byl vyvinut krátký koinkubační inseminační protokol. To znamená, že dlouhodobá společná inkubace oocytů a spermií nemusí být nutná a může být dokonce škodlivá. Některé zprávy naznačují, že doba expozice spermií a oocytů 1–6 hodin zlepšuje výsledky IVF[1,2,6,7] Jiné studie však neuvádějí žádnou takovou výhodu při krátké době inseminace[8,9,10].

   Nedávno publikovaná Meta analýza ukazuje[11], že krátká koinkubace gamet byla spojena s významně vyšší mírou klinického těhotenství (RR: 1,84, 95% CI: 1,24-2,73), probíhající těhotenství (RR: 1,73, 95% CI: 1,27-2,33) a vyšší rychlost implantace (RR: 1,80, 95% CI: 1,43-2,26) než standardní inseminace. Ale míra normálního oplodnění (RR: 0,98, 95% CI: 0,93-1,02), embrya dobré kvality (RR: 1,24, 95% CI: 1,0-1,53) a polyspermie (RR: 0,84, 95% CI: 0,7-1,01) se významně nelišily ve srovnání se standardní inseminací. V jiné Cochranově metaanalýze[12] bylo zahrnuto osm RCT se 733 ženami, které získaly podobné výsledky. Uváděla však pouze klinickou míru těhotenství, četnost pokračující březosti, která byla významně vyšší ve skupině s krátkou koinkubací než standardní inseminace. Pokud jde o míru potratů, v jedné studii došlo k šesti potratům, včetně 167 žen. Tento důkaz nízké kvality nenaznačoval žádný významný rozdíl v pravděpodobnosti potratu mezi krátkou koinkubací a standardní inseminací (OR 1,98, 95% CI 0,35 až 11,09; P = 0,44). A živé porody nebyly v zahrnutých studiích hlášeny, není jasné, zda krátká společná inkubace zlepšuje celoživotní porodnost ve srovnání se standardním protokolem noční inseminace.

   Nevýhody spojené s kvalitou těchto studií, jako je nedostatek utajování alokace a žádné zaslepení, omezují kvalitu dostupných důkazů. Aby bylo možné tyto problémy lépe vyhodnotit, je zapotřebí lépe navržených RCT, aby bylo možné posoudit, zda by krátká společná inkubace přispěla k vyšší míře porodnosti a nižší míře potratů ve srovnání se standardním protokolem noční inseminace.

2. Cíle:

   Cílem této randomizované, dvojitě zaslepené kontrolované studie je porovnat klinickou účinnost (zejména na živou porodnost) kratší expozice oocytu spermiím ve srovnání se standardní inkubací u žen podstupujících léčbu IVF.

3. Zkušební design:

Celkem 280 neplodných žen podstupujících léčbu IVF bude náhodně rozděleno do jedné z následujících dvou skupin pomocí počítačem generovaných náhodných čísel, která byla umístěna do zapečetěných obálek:

Kratší expozice oocytu spermiím skupina: oocyty budou vystaveny spermiím po dobu 2 hodin Standardní inkubační skupina: oocyty budou vystaveny spermiím po dobu 20 hodin

Léčba subjektů

Všechny techniky IVF včetně ovariální stimulace budou probíhat podle místních protokolů.

4.1 Ovariální stimulace a IVF

Všechny ženy zahájily léčbu IVF ovariální stimulací buď pomocí dlouhého agonistického nebo antagonistického protokolu. U dlouhého protokolu jim bude podán analog hormonu uvolňujícího gonadotropin (GnRHa) k desenzibilizaci hypofýzy, 2.–3. den menstruačního cyklu podstoupí transvaginální ultrazvukové vyšetření a měření E2 v séru. Lidský menopauzální gonadotropin (hMG) nebo rekombinantní FSH budou zahájeny dávkou 150-300 IU denně na základě počtu antrálních folikulů, věku ženy a předchozí ovariální odpovědi, podle standardních operačních postupů centra. Ovariální odpověď byla monitorována sériovým transvaginálním skenováním s hormonálním monitorováním nebo bez něj. Další úpravy dávkování budou založeny na ovariální odpovědi podle uvážení odpovědných lékařů. Pro antagonistické protokoly antagonista (cetritide0,25 mg denně) bude podáván 6. den ovariální stimulace až do dne primingu hcg.

Když byly tři přední folikuly ≥18 mm, bude podán hCG 10 000 IU nebo ovidrel 250 mg ke spuštění konečného zrání oocytů. Odběry oocytů budou uspořádány přibližně o 36 hodin později.

4.2 Postupy inseminace

Všechny vzorky spermatu byly připraveny běžným postupem plavání. 2 hodiny po odebrání oocytu bude každý zralý oocyt inseminován přibližně 50 000-100 000 pohyblivými spermiemi.

4.3. Přiřazení a maskování

V den OPU budou pacienti po odběru ocytů laborantem randomizováni podle počítačem generovaného randomizačního seznamu v zapečetěných obálkách do kratší inkubační skupiny nebo do kontrolní skupiny. Do ukončení celé studie byli jak pacienti, tak kliničtí lékaři zaslepeni do přidělené skupiny.

Kontrolní rameno Ženy, které byly zařazeny do kontrolního ramene, budou všechny oocyty vystaveny spermiím po dobu 20 hodin a zkontrolovány na oplodnění v den 1 (20 hodin) po obnažení

Intervenční rameno Pro ty, kteří jsou zařazeni do intervenčního ramene, budou všechny oocyty vystaveny spermiím po dobu 2 hodin a jemně promyty dvěma miskami s orgány obsahujícími 1,5 ml ekvilibrovaného média a poté přeneseny do odpovídající mikrokapky ekvilibrovaného čerstvého média. Okolní kupovitá buňka zůstane zachována, nebude odstraněna z ooktyů.

4.4 Fertilizace a hodnocení embrya Obě skupiny oocytů budou ozdobeny a zkontrolovány na přítomnost dvou pronukleů a dvou polárních tělísek, aby se potvrdilo oplodnění. Všechny ostatní výsledky (tj. žádné oplodnění, jedno pronukleus, polyspermie, degenerace) byly také zaznamenány.

Morfologie embrya bude hodnocena každý den kultivace. Embrya budou hodnocena podle následujících kritérií. Stručně, embrya jsou klasifikována jako: stupeň A, žádná buněčná fragmentace; stupeň B, <20% fragmentace; stupeň C, 20 % až 50 % fragmentace; a stupeň D, >50% fragmentace. Byl také zaznamenán počet blastomer na embryo. Embrya stupně A a B představovala „embrya dobré kvality“.

Transfer provádí týmový klinik s maximálně 2 nahrazenými embryi podle standardního protokolu pod transabdominálním ultrazvukovým vedením. Podpora luteální fáze se poskytuje podle uvážení lékaře.

4.5 Následná strategie:

Těhotenský test bude proveden 2 týdny po přenosu embrya na obou pažích. Všechny ženy, které mají pozitivní těhotenský test 2 týdny po přenosu čerstvého embrya, podstoupí po dalších 5 týdnech transvaginální ultrazvukové vyšetření k identifikaci přítomnosti gestačního váčku se srdcem plodu, což znamená probíhající těhotenství.

Budou shromažďovány údaje o všech výsledcích těhotenství včetně časných ztrát těhotenství, jako je potrat nebo mimoděložní těhotenství.

Aby bylo dosaženo konzistence s ohledem na sběr výsledků, budou pro každou ženu v každém centru vyplněny standardizované formuláře kazuistik (CRF). Tyto CRF budou zahrnovat podrobnosti o přijaté léčbě, výsledcích těhotenství, komplikacích v těhotenství, způsobu porodu a výsledcích porodu.

Statistika

5.1 Plán analýzy: Demografické faktory a klinické charakteristiky shromážděné jako součást sběru výchozích dat budou shrnuty s počty (v procentech) pro kategorické proměnné, průměrem (směrodatná odchylka [SD]) pro normálně rozdělené spojité proměnné nebo mediánem (interkvartil [IQR] nebo celý rozsah) pro další spojité proměnné.

Výsledky pro účastníky budou analyzovány ve skupinách, do kterých jsou zařazeni, bez ohledu na odchylku od protokolu nebo přijaté léčby (intention-to-treat). Srovnávací statistická analýza bude zahrnovat výpočet relativního rizika (RR) (95% CI) pro primární výsledek (99% CI pro všechny dichotomické sekundární výsledky), středního rozdílu (99% CI) pro normálně rozdělené kontinuální sekundární výsledky nebo mediánu rozdíl (99% CI) pro zkreslené spojité proměnné.

Všechny analýzy se přizpůsobí minimalizačním faktorům, aby zohlednily korelaci mezi léčebnými skupinami zavedenou vyvážením randomizace (která nutí, aby byly výsledky mezi léčebnými rameny podobné kromě jakéhokoli účinku léčby).

Upravené rizikové poměry budou odhadnuty pomocí log binomického regresního modelu nebo pomocí log Poissonova regresního modelu s robustním odhadem rozptylu, pokud selže binomický model konvergovat. Lineární regrese bude použita pro normálně rozdělené výsledky a kvantilová regrese pro zkreslené spojité proměnné.

Předem specifikované analýzy podskupin budou zahrnovat štěpení versus přenos stadia blastocysty.

6. Odhad velikosti vzorku:

Průměrná porodnost v našem centru v letech 2010-2012 byla 30 % na jeden transfer. Podle nedávno publikované Meta analýzy[11] byla krátká koinkubace gamet spojena s významně vyšší mírou probíhajícího těhotenství (RR: 1,73, 95% CI: 1,27-2,33). než standardní inseminace.

Za předpokladu živě narozených v léčené skupině = 50 % (nárůst o 70 %); s 90% mocí a oboustrannou 5% hladinou statistické významnosti budeme muset přijmout 124 žen v každé větvi. Abychom započítali 10% ztrátu na sledování, přijmeme 140 subjektů v každé skupině nebo 280 subjektů pro celou studii.

7. Posouzení bezpečnosti

Výsledky z nedávno publikované Metaanalýzy[11,12] ukázaly, že míra normálního oplodnění, kvalitní embrya a polyspermie se významně nelišily při krátké době inkubace gamet ve srovnání se standardní inseminací. V této studii by tedy neměly existovat žádné velké bezpečnostní obavy.

8. Přímý přístup ke zdrojovým datům/dokumentům:

Monitorování, audity, IRB revize a regulační inspekce jsou povoleny.

9. Kontrola a zajištění kvality

Pacienti budou vedeni uvedenými zkoušejícími, kteří mají dostatečné zkušenosti s řízením léčby asistované reprodukce. Bude vytvořena Řídící komise soudu, která bude dohlížet na průběh soudu.

10. Etika

Od všech pacientů bude získán písemný souhlas. Informační list pro pacienta a formuláře souhlasu v angličtině a čínštině jsou přiloženy. Schválení etiky bude získáno od Institutional Review Board, Šanghajské první porodnice a nemocnice pro kojence.

11. Nakládání s daty a vedení záznamů

Všechna data budou uložena po dobu tří let. Určená výzkumná sestra bude zodpovědná za správu dat včetně kódování dat, monitorování a ověřování.

12. Financování a pojištění

Studie bude financována z fondu MerckSerono China Research Fund for Fertility Experts.

13. Publikační politika

Výsledky této studie budou předloženy ke zvážení k publikaci v recenzovaném vědeckém časopise.

14. Doplňky

Studie bude provedena v souladu s Helsinskou deklarací a správnou klinickou praxí (ICH-GCP)