Uno studio che confronta un'esposizione più breve dell'ovocita agli spermatozoi rispetto a un'incubazione standard sul tasso di natalità dal vivo del trattamento di fecondazione in vitro

1. Sfondo

   La tecnica della fecondazione in vitro (FIV) è ora comunemente utilizzata per il trattamento delle coppie infertili. Per ottenere risultati migliori dalla fecondazione in vitro, è importante migliorare la qualità dell'embrione ottimizzando le tecniche di fecondazione in vitro. Nelle procedure di fecondazione in vitro, gli ovociti e lo sperma vengono regolarmente co-incubati durante la notte, il che può esporre gli ovociti e gli zigoti a condizioni di coltura non ottimali con un aumento delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) prodotte dallo sperma in questa coltura a lungo termine[1]. Alti livelli di specie reattive dell'ossigeno (ROS) possono influenzare negativamente la qualità degli embrioni, provocare l'indurimento della zona pellucida e compromettere la capacità di impianto degli embrioni [2-4]. Gli studi dimostrano che la fecondazione di successo di un ovocita mammario avviene 20 minuti dopo l'incontro dei gameti [5]. Lo sperma può penetrare attraverso le cellule del cumulo entro 15 minuti e l'80% degli ovociti può essere fecondato quando sono esposti a un gran numero di spermatozoi entro 1 ora[1]. Nel tentativo di evitare possibili effetti dannosi sugli ovociti dovuti a una lunga esposizione allo sperma, è stato sviluppato il protocollo di inseminazione con co-incubazione breve. Ciò implica che la co-incubazione a lungo termine di ovociti e spermatozoi potrebbe non essere necessaria e potrebbe persino essere dannosa. Alcuni rapporti suggeriscono che un tempo di esposizione spermatozoo-ovocita di 1-6 ore migliora i risultati della fecondazione in vitro[1,2,6,7] Tuttavia, altri studi non riportano tale vantaggio con un tempo di inseminazione breve[8,9,10] .

   La recente meta-analisi pubblicata mostra[11] che una breve co-incubazione dei gameti è stata associata a tassi significativamente più elevati di gravidanza clinica (RR: 1,84, IC 95%: 1,24-2,73), gravidanza in corso (RR: 1,73, IC 95%: 1,27-2,33) e più alto tasso di impianto (RR: 1,80, IC 95%: 1,43-2,26) rispetto all'inseminazione standard. Ma i tassi di fecondazione normale (RR: 0,98, IC 95%: 0,93-1,02), embrioni di buona qualità (RR: 1,24, IC 95%: 1,0-1,53) e polispermia (RR: 0,84, IC 95%: 0,7-1,01) non erano significativamente differenti rispetto all'inseminazione standard. In un'altra meta-analisi Cochrane[12] sono stati inclusi otto RCT con 733 donne, che hanno ottenuto risultati simili. Ma ha riportato solo il tasso di gravidanza clinica, il tasso di gravidanza in corso che era significativamente più alto nel gruppo di co-incubazione breve rispetto all'inseminazione standard. Per il tasso di aborto spontaneo, ci sono stati sei aborti spontanei in uno studio che includeva 167 donne. Questa prova di bassa qualità non ha suggerito alcuna differenza significativa nelle probabilità di aborto spontaneo tra breve co-incubazione e inseminazione standard (OR 1,98, IC 95% da 0,35 a 11,09; P = 0,44). E la nascita dal vivo non è stata riportata negli studi inclusi, non è chiaro se la breve co-incubazione migliori il tasso di natalità rispetto al protocollo standard di inseminazione notturna.

   Gli inconvenienti inerenti alla qualità di questi studi, come la mancanza di occultamento dell'allocazione e l'assenza di accecamento, limitano la qualità delle prove disponibili. Per valutare meglio questi problemi, sono necessari RCT più ben progettati per valutare se una breve co-incubazione contribuirebbe a un tasso di natalità vivo più elevato e un tasso di aborto spontaneo inferiore rispetto al protocollo standard di inseminazione notturna.

2. Obiettivi:

   L'obiettivo del presente studio controllato, randomizzato, in doppio cieco è quello di confrontare l'efficacia clinica (soprattutto sul tasso di nati vivi) di un'esposizione più breve dell'ovocita agli spermatozoi rispetto a un'incubazione standard nelle donne sottoposte a trattamento di fecondazione in vitro.

3. Progetto di prova:

Un totale di 280 donne infertili sottoposte a trattamento di fecondazione in vitro saranno randomizzate in uno dei due gruppi seguenti in base a numeri casuali generati dal computer che sono stati inseriti in buste sigillate:

Esposizione più breve dell'ovocita al gruppo degli spermatozoi: gli ovociti saranno esposti agli spermatozoi per 2 ore Gruppo di incubazione standard: gli ovociti saranno esposti agli spermatozoi per 20 ore

Trattamento dei soggetti

Tutte le tecniche di fecondazione in vitro, inclusa la stimolazione ovarica, saranno conformi ai protocolli locali.

4.1 Stimolazione ovarica e fecondazione in vitro

Tutte le donne hanno iniziato il trattamento di fecondazione in vitro con stimolazione ovarica utilizzando il protocollo agonista lungo o quello antagonista. Per il protocollo lungo, verrà somministrato l'analogo dell'ormone di rilascio delle gonadotropine (GnRHa) per la desensibilizzazione ipofisaria, il giorno 2-3 del ciclo mestruale, saranno sottoposti a esame ecografico transvaginale e misurazione dell'E2 sierico. La gonadotropina umana della menopausa (hMG) o l'FSH ricombinante inizieranno a 150-300 UI al giorno in base alla conta dei follicoli antrali, all'età delle donne e alla precedente risposta ovarica, secondo le procedure operative standard del centro. La risposta ovarica è stata monitorata mediante scansione transvaginale seriale con o senza monitoraggio ormonale. Ulteriori aggiustamenti del dosaggio si baseranno sulla risposta ovarica a discrezione dei medici responsabili. Per protocolli antagonisti, antagonista (cetritide0.25mg giornalmente) verrà somministrato il 6° giorno di stimolazione ovarica fino al giorno del priming hcg.

Quando tre follicoli principali erano ≥18 mm, verranno somministrati hCG 10.000 UI o ovidrel 250 mg per innescare la maturazione finale degli ovociti. I prelievi di ovociti saranno organizzati circa 36 ore dopo.

4.2 Procedure di inseminazione

Tutti i campioni di seme sono stati preparati con la procedura swim-up convenzionale. Due ore dopo il prelievo degli ovociti, ogni ovocita maturo sarà inseminato con circa 50.000-100.000 spermatozoi mobili.

4.3. Assegnazione e mascheramento

Il giorno dell'OPU, i pazienti verranno randomizzati dopo il prelievo degli occiti da un tecnico di laboratorio secondo un elenco di randomizzazione generato dal computer in buste sigillate nel gruppo di incubazione più breve o nel gruppo di controllo. Fino al completamento dell'intero studio, sia i pazienti che i medici erano all'oscuro del gruppo assegnato.

Braccio di controllo Donne assegnate al braccio di controllo, tutti gli ovociti saranno esposti agli spermatozoi per 20 ore e controllati per la fecondazione il giorno 1 (20 ore) dopo la denudazione

Braccio di intervento Per quelli assegnati al braccio di intervento, tutti gli ovociti saranno esposti agli spermatozoi per 2 ore e lavati delicatamente attraverso due piatti per organi contenenti 1,5 ml di terreno equilibrato, quindi trasferiti nella corrispondente microgoccia di terreno fresco equilibrato. La cellula del cumulo circostante sarà trattenuta, non rimossa dagli ooctye.

4.4 Fecondazione e valutazione dell'embrione Entrambi i gruppi di ovociti saranno decoronati e controllati per la presenza di due pronuclei e due corpi polari per confermare la fecondazione. Sono stati registrati anche tutti gli altri esiti (cioè nessuna fecondazione, un pronucleo, polispermia, degenerazione).

La morfologia dell'embrione sarà valutata ogni giorno di coltura. Gli embrioni saranno valutati secondo i seguenti criteri. In breve, gli embrioni sono classificati come: grado A, nessuna frammentazione cellulare; grado B, frammentazione <20%; grado C, frammentazione dal 20% al 50%; e grado D, frammentazione >50%. È stato registrato anche il numero di blastomeri per embrione. Gli embrioni di grado A e B costituivano "l'embrione di buona qualità".

Il trasferimento viene eseguito dal medico del team con un massimo di 2 embrioni sostituiti secondo il protocollo standard sotto guida ecografica transaddominale. Il supporto della fase luteale viene fornito a discrezione del medico.

4.5 Strategia di follow-up:

Un test di gravidanza sarà effettuato 2 settimane dopo il trasferimento dell'embrione in entrambe le braccia. Tutte le donne che hanno un test di gravidanza positivo 2 settimane dopo un nuovo trasferimento di embrioni saranno sottoposte a un'ecografia transvaginale dopo altre 5 settimane per identificare la presenza di un sacco gestazionale con un cuore fetale che indica una gravidanza in corso.

Verranno raccolti dati su tutti gli esiti della gravidanza, comprese le perdite precoci di gravidanza come aborto spontaneo o gravidanza extrauterina.

Al fine di raggiungere la coerenza rispetto alla raccolta dei risultati, saranno compilati moduli standardizzati di segnalazione dei casi (CRF) per ogni donna in ciascun centro. Questi CRF includeranno dettagli sul trattamento ricevuto, esiti della gravidanza, complicanze in gravidanza, modalità di parto ed esiti della nascita.

Statistiche

5.1 Piano di analisi: i fattori demografici e le caratteristiche cliniche raccolti come parte della raccolta dei dati di riferimento saranno riassunti con conteggi (percentuali) per variabili categoriali, media (deviazione standard [SD]) per variabili continue normalmente distribuite o mediana (interquartile [IQR] o intero intervallo) per altre variabili continue.

I risultati per i partecipanti saranno analizzati nei gruppi a cui sono assegnati indipendentemente dalla deviazione dal protocollo o dal trattamento ricevuto (intenzione di trattare). L'analisi statistica comparativa comporterà il calcolo del rischio relativo (RR) (IC 95%) per l'esito primario (IC 99% per tutti gli esiti secondari dicotomici), la differenza media (IC 99%) per gli esiti secondari continui normalmente distribuiti o la mediana differenza (IC 99%) per variabili continue asimmetriche.

Tutte le analisi si adegueranno ai fattori di minimizzazione per tenere conto della correlazione tra i gruppi di trattamento introdotti bilanciando la randomizzazione (che costringe i risultati tra i bracci di trattamento a essere simili a prescindere da qualsiasi effetto del trattamento).

I rapporti di rischio aggiustati saranno stimati utilizzando un modello di regressione binomiale logaritmica o utilizzando un modello di regressione logaritmica di Poisson con un robusto stimatore della varianza se il modello binomiale non riesce a convergere. La regressione lineare verrà utilizzata per risultati distribuiti normalmente e la regressione quantile per variabili continue asimmetriche.

Le analisi di sottogruppi pre-specificate includeranno la scissione rispetto al trasferimento dello stadio di blastocisti.

6. Stima della dimensione del campione:

Il tasso medio di nati vivi nel nostro centro dal 2010 al 2012 è stato del 30% per trasferimento. Secondo la recente Meta analisi pubblicata[11], una breve co-incubazione dei gameti è stata associata a tassi significativamente più elevati di gravidanza in corso (RR: 1,73, IC 95%: 1,27-2,33) rispetto all'inseminazione standard.

Supponendo nati vivi nel gruppo di trattamento =50% (aumento del 70%); con una potenza del 90% e un livello di significatività statistica bilaterale del 5%, dovremo reclutare 124 donne per braccio. Per tenere conto della perdita del 10% al follow-up, recluteremo 140 soggetti in ciascun gruppo o 280 soggetti per l'intero studio.

7. Valutazione della sicurezza

I risultati della recente meta-analisi pubblicata[11,12] hanno mostrato che i tassi di fecondazione normale, embrioni di buona qualità e polispermia non erano significativamente diversi con un'incubazione di breve durata dei gameti rispetto all'inseminazione standard. Pertanto, in questo studio non dovrebbero esserci grossi problemi di sicurezza.

8. Accesso diretto ai dati/documenti di origine:

Sono consentiti il ​​monitoraggio, gli audit, la revisione dell'IRB e le ispezioni regolamentari relative alla sperimentazione.

9. Controllo di qualità e garanzia di qualità

I pazienti saranno gestiti dagli investigatori elencati che hanno un'esperienza adeguata nella gestione dei trattamenti di riproduzione assistita. Verrà formato un comitato direttivo del processo che sovrintenderà allo svolgimento del processo.

10. Etica

Il consenso scritto sarà ottenuto da tutti i pazienti. La scheda informativa per il paziente ei moduli di consenso in inglese e cinese sono allegati. L'approvazione etica sarà ottenuta dall'Institutional Review Board, il primo ospedale ospedaliero per la maternità e la salute infantile di Shanghai.

11. Trattamento dei dati e tenuta dei registri

Tutti i dati saranno conservati per tre anni. Un infermiere ricercatore designato sarà responsabile della gestione dei dati, inclusa la codifica, il monitoraggio e la verifica dei dati.

12. Finanziamenti e assicurazioni

Lo studio sarà finanziato dal MerckSerono China Research Fund for Fertility Experts.

13. Politica di pubblicazione

I risultati di questo studio saranno sottoposti all'esame per la pubblicazione su una rivista scientifica sottoposta a revisione paritaria.

14. Supplementi

Lo studio sarà condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki e la buona pratica clinica (ICH-GCP)