Een studie waarin een kortere blootstelling van oöcyten aan spermatozoa wordt vergeleken met een standaardincubatie op het levend geboortecijfer van in-vitrofertilisatiebehandeling

1. Achtergrond

   In vitro fertilisatie (IVF) techniek wordt nu algemeen gebruikt voor de behandeling van onvruchtbare koppels. Om betere resultaten van IVF te verkrijgen, is het belangrijk om de embryokwaliteit te verbeteren door IVF-technieken te optimaliseren. Bij IVF-procedures worden oöcyten en sperma routinematig 's nachts samen geïncubeerd, waardoor oöcyten en zygoten kunnen worden blootgesteld aan suboptimale kweekomstandigheden met verhoogde reactieve zuurstofspecies (ROS) geproduceerd door sperma in deze langdurige kweek[1]. Hoge niveaus van reactieve zuurstofspecies (ROS) kunnen de kwaliteit van de embryo's negatief beïnvloeden, leiden tot verharding van de zona pellucida en de implantatiecapaciteit van embryo's aantasten [2-4]. Studies tonen aan dat succesvolle bevruchting van een zoogdieroöcyt plaatsvindt 20 minuten nadat gameten elkaar ontmoeten [5]. Sperma kan binnen 15 minuten door de cumuluscellen dringen en 80% van de eicellen kan worden bevrucht wanneer ze binnen 1 uur worden blootgesteld aan een groot aantal spermatozoa [1]. Als een poging om mogelijke nadelige effecten op de oöcyten door langdurige blootstelling aan sperma te voorkomen, werd het korte co-incubatie-inseminatieprotocol ontwikkeld. Het impliceert dat co-incubatie op lange termijn van oöcyten en sperma misschien niet nodig is en zelfs schadelijk kan zijn. Sommige rapporten suggereren dat een sperma-oöcyt-blootstellingstijd van 1-6 uur de IVF-uitkomsten verbetert [1,2,6,7] Andere studies rapporteren echter niet zo'n voordeel met een korte inseminatietijd [8,9,10] .

   Recent gepubliceerde meta-analyse toont[11] korte co-incubatie van gameten was geassocieerd met significant hogere percentages klinische zwangerschap (RR: 1,84, 95% CI: 1,24-2,73), doorgaande zwangerschap (RR: 1.73, 95%CI: 1.27-2.33) en hoger implantatiepercentage (RR: 1,80, 95% CI: 1,43-2,26) dan standaard inseminatie. Maar de tarieven van normale bevruchting (RR: 0,98, 95% BI: 0,93-1,02), embryo's van goede kwaliteit (RR: 1,24, 95% BI: 1,0-1,53) en polyspermie (RR: 0,84, 95% BI: 0,7-1,01) waren niet significant verschillend in vergelijking met standaard inseminatie. In een andere Cochrane-meta-analyse[12] werden acht RCT's met 733 vrouwen opgenomen, die vergelijkbare resultaten opleverden. Maar het rapporteerde alleen het klinische zwangerschapspercentage, het percentage doorgaande zwangerschappen dat significant hoger was in de korte co-incubatiegroep dan standaard inseminatie. Voor het miskraampercentage waren er zes miskramen in één proef met 167 vrouwen. Dit bewijs van lage kwaliteit suggereerde geen significant verschil in de kans op een miskraam tussen korte co-incubatie en standaardinseminatie (OR 1,98, 95% CI 0,35 tot 11,09; P = 0,44). En levendgeborenen werden niet gerapporteerd in de opgenomen onderzoeken, het is onduidelijk of korte co-incubatie het aantal levensgeboorten verbetert in vergelijking met het standaard nachtelijke inseminatieprotocol.

   Nadelen die inherent zijn aan de kwaliteit van deze onderzoeken, zoals het ontbreken van toewijzingsverberging en geen verblinding, beperken de kwaliteit van het beschikbare bewijsmateriaal. Om deze problemen beter te kunnen evalueren, zijn beter opgezette RCT's nodig om te beoordelen of korte co-incubatie zou bijdragen aan een hoger aantal levendgeborenen en een lager aantal miskramen in vergelijking met het standaard 's nachts inseminatieprotocol.

2. Doelstellingen:

   Het doel van de huidige gerandomiseerde, dubbelblinde gecontroleerde studie is om de klinische effectiviteit (vooral op levend geboortecijfer) van een kortere blootstelling van eicel aan spermatozoa te vergelijken met een standaard incubatie bij vrouwen die een IVF-behandeling ondergaan.

3. Proefopzet:

Een totaal van 280 onvruchtbare vrouwen die een IVF-behandeling ondergaan, worden gerandomiseerd in een van de volgende twee groepen door middel van door de computer gegenereerde willekeurige getallen die in verzegelde enveloppen zijn geplaatst:

Kortere blootstelling van eicel aan spermatozoagroep: oöcyten worden gedurende 2 uur blootgesteld aan spermatozoa Standaard incubatiegroep: oöcyten worden gedurende 20 uur blootgesteld aan spermatozoa

Behandeling van proefpersonen

Alle IVF-technieken, inclusief ovariële stimulatie, zijn volgens lokale protocollen.

4.1 Eierstokstimulatie en IVF

Alle vrouwen begonnen hun IVF-behandeling met ovariële stimulatie met behulp van de lange-agonist- of antagonist-protocollen. Voor een lang protocol zal gonadotropine-releasing hormoonanaloog (GnRHa) worden gegeven voor hypofyse-desensibilisatie, op dag 2-3 van de menstruatiecyclus zullen ze een transvaginaal echografisch onderzoek en serum E2-meting ondergaan. Humaan menopauzaal gonadotrofine (hMG) of recombinant FSH wordt gestart met 150-300 IE per dag op basis van het aantal antrale follikels, de leeftijd van de vrouw en de eerdere ovariële respons, volgens de standaard operatieprocedures van het centrum. De ovariële respons werd gecontroleerd door seriële transvaginale scans met of zonder hormonale monitoring. Verdere dosisaanpassingen zullen gebaseerd zijn op de ovariële respons naar goeddunken van de verantwoordelijke clinici. Voor antagonistprotocollen, antagonist (cetritide 0,25 mg dagelijks) zal worden gegeven op de 6e dag van de ovariële stimulatie tot de dag van hcg-priming.

Wanneer drie leidende follikels ≥18 mm waren, zal hCG 10 000 IE of ovidrel 250 mg worden gegeven om de uiteindelijke rijping van eicellen op gang te brengen. De eicelpunctie wordt ongeveer 36 uur later geregeld.

4.2 Inseminatieprocedures

Alle spermamonsters werden bereid door middel van de conventionele swim-up procedure. Twee uur na het ophalen van de eicel wordt elke rijpe eicel geïnsemineerd met ongeveer 50.000-100.000 beweeglijke spermatozoa.

4.3. Toewijzing en maskering

Op de dag van OPU worden patiënten gerandomiseerd nadat de occyten zijn opgehaald door een laboratoriumtechnicus volgens een computergegenereerde randomisatielijst in verzegelde enveloppen in de kortere incubatiegroep of de controlegroep. Tot de voltooiing van het hele onderzoek waren zowel de patiënten als de clinici blind voor de toegewezen groep.

Controle-arm Vrouwen die naar de controle-arm zijn gegaan, zullen alle eicellen gedurende 20 uur worden blootgesteld aan spermatozoa en op dag 1 (20 uur) na ontbloting worden gecontroleerd op bevruchting

Interventie-arm Voor diegenen die zijn toegewezen aan de interventie-arm, worden alle oöcyten gedurende 2 uur blootgesteld aan spermatozoa en worden ze voorzichtig door twee orgaanschalen met 1,5 ml geëquilibreerd medium gewassen en vervolgens overgebracht naar de overeenkomstige microdruppel van geëquilibreerd vers medium. Omringende cumuluscellen blijven behouden, niet verwijderd uit de eicellen.

4.4 Bevruchting en embryo-evaluatie Beide eicelgroepen worden gedecoreerd en gecontroleerd op de aanwezigheid van twee pronuclei en twee poollichaampjes om bevruchting te bevestigen. Alle andere uitkomsten (d.w.z. geen bevruchting, één pronucleus, polyspermia, degeneratie) werden ook geregistreerd.

Embryomorfologie zal elke kweekdag worden beoordeeld. Embryo's worden gescoord volgens de volgende criteria. In het kort worden embryo's geclassificeerd als: graad A, geen cellulaire fragmentatie; graad B, <20% fragmentatie; graad C, 20% tot 50% fragmentatie; en graad D, >50% fragmentatie. Ook werd het aantal blastomeren per embryo geregistreerd. Graad A- en B-embryo's vormden het "embryo van goede kwaliteit".

De terugplaatsing wordt uitgevoerd door de teamarts waarbij maximaal 2 embryo's worden teruggeplaatst volgens het standaardprotocol onder transabdominale echografie. Ondersteuning in de luteale fase wordt gegeven naar goeddunken van de arts.

4.5 Vervolgstrategie:

2 weken na terugplaatsing van het embryo in beide armen wordt een zwangerschapstest uitgevoerd. Alle vrouwen die 2 weken na een verse embryotransfer een positieve zwangerschapstest hebben, zullen na nog eens 5 weken een transvaginale echografie ondergaan om de aanwezigheid van een draagzak met een foetaal hart te identificeren, wat duidt op een doorgaande zwangerschap.

Gegevens over alle zwangerschapsuitkomsten, inclusief vroege zwangerschapsverliezen zoals een miskraam of buitenbaarmoederlijke zwangerschap, zullen worden verzameld.

Om consistentie te bereiken met betrekking tot het verzamelen van uitkomsten, zullen in elk centrum voor elke vrouw gestandaardiseerde casusrapportformulieren (CRF) worden ingevuld. Deze CRF's bevatten details over de ontvangen behandeling, zwangerschapsuitkomsten, complicaties tijdens de zwangerschap, wijze van bevalling en geboorteuitkomsten.

Statistieken

5.1 Analyseplan: Demografische factoren en klinische kenmerken die zijn verzameld als onderdeel van de basisgegevensverzameling zullen worden samengevat met tellingen (percentages) voor categorische variabelen, gemiddelde (standaarddeviatie [SD]) voor normaal verdeelde continue variabelen, of mediaan (interkwartiel [IQR] of gehele bereik) voor andere continue variabelen.

Uitkomsten voor deelnemers worden geanalyseerd in de groepen waarin ze zijn ingedeeld, ongeacht de afwijking van het protocol of de ontvangen behandeling (intention-to-treat). Vergelijkende statistische analyse omvat het berekenen van het relatieve risico (RR) (95% BI) voor de primaire uitkomst (99% BI voor alle dichotome secundaire uitkomsten), het gemiddelde verschil (99% BI) voor normaal verdeelde continue secundaire uitkomsten, of de mediaan verschil (99% BI) voor scheve continue variabelen.

Alle analyses zullen worden gecorrigeerd voor de minimaliseringsfactoren om rekening te houden met de correlatie tussen behandelingsgroepen die zijn geïntroduceerd door de randomisatie in evenwicht te brengen (waardoor de uitkomsten tussen behandelingsarmen worden gedwongen vergelijkbaar te zijn, afgezien van enig behandelingseffect).

Gecorrigeerde risicoverhoudingen zullen worden geschat met behulp van een log binomiaal regressiemodel, of met behulp van een log Poisson-regressiemodel met een robuuste variantieschatter als het binominale model niet convergeert. Lineaire regressie wordt gebruikt voor normaal verdeelde uitkomsten en kwantielregressie voor scheve continue variabelen.

Vooraf gespecificeerde subgroepanalyses omvatten overdracht van splitsing versus blastocyststadium.

6. Schatting van de steekproefomvang:

Het gemiddelde aantal levendgeborenen in ons centrum van 2010-2012 was 30% per overplaatsing. Volgens recent gepubliceerde Meta-analyse[11] was korte co-incubatie van gameten geassocieerd met significant hogere percentages doorgaande zwangerschap (RR: 1.73, 95%CI: 1.27-2.33) dan standaard inseminatie.

Uitgaande van een levendgeborene in de behandelingsgroep =50% (toename met 70%); met 90% power en een tweezijdig 5% niveau van statistische significantie, zullen we 124 vrouwen in elke arm moeten rekruteren. Om rekening te houden met 10% verlies voor follow-up, rekruteren we 140 proefpersonen in elke groep of 280 proefpersonen voor het hele onderzoek.

7. Beoordeling van de veiligheid

Recults van recent gepubliceerde Meta-analyse [11,12] toonden aan dat de snelheden van normale bevruchting, embryo's van goede kwaliteit en polyspermie niet significant verschilden met korte incubatie van gameten in vergelijking met standaard inseminatie. Er zouden dus geen grote veiligheidsproblemen in deze studie moeten zijn.

8. Directe toegang tot brongegevens / documenten:

Proefgerelateerde monitoring, audits, IRB-beoordeling en regelgevende inspecties zijn toegestaan.

9. Kwaliteitscontrole en kwaliteitsborging

Patiënten zullen worden behandeld door de vermelde onderzoekers die voldoende ervaring hebben met het beheer van geassisteerde voortplantingsbehandelingen. Er zal een proefstuurgroep worden gevormd die toezicht zal houden op de uitvoering van de proef.

10. Ethiek

Van alle patiënten wordt schriftelijke toestemming gevraagd. Het patiënteninformatieblad en toestemmingsformulieren in het Engels en Chinees zijn bijgevoegd. Ethische goedkeuring zal worden verkregen van de Institutional Review Board, het Shanghai First Maternity and Infant Health Hospital Hospital.

11. Gegevensverwerking en archivering

Alle gegevens worden drie jaar bewaard. Een aangewezen onderzoeksverpleegkundige zal verantwoordelijk zijn voor gegevensbeheer, inclusief gegevenscodering, monitoring en verificatie.

12. Financiering en verzekering

De studie zal worden gefinancierd door MerckSerono China Research Fund for Fertility Experts.

13. Publicatiebeleid

De bevindingen van deze studie zullen ter overweging worden voorgelegd voor publicatie in een collegiaal getoetst wetenschappelijk tijdschrift.

14. Supplementen

De studie zal worden uitgevoerd in overeenstemming met de Declaration of Helsinki and Good Clinical Practice (ICH-GCP)