Badanie porównujące krótszą ekspozycję oocytu na plemniki w porównaniu ze standardową inkubacją na wskaźnik żywych urodzeń w leczeniu zapłodnieniem in vitro

1. Tło

   Technika zapłodnienia in vitro (IVF) jest obecnie powszechnie stosowana w leczeniu niepłodnych par. Aby uzyskać lepsze wyniki IVF, ważne jest, aby poprawić jakość zarodków poprzez optymalizację technik IVF. W procedurach IVF oocyty i plemniki są rutynowo wspólnie inkubowane przez noc, co może narażać oocyty i zygoty na suboptymalne warunki hodowli ze zwiększonymi reaktywnymi formami tlenu (ROS) wytwarzanymi przez plemniki w tej długoterminowej hodowli[1]. Wysoki poziom reaktywnych form tlenu (ROS) może niekorzystnie wpływać na jakość zarodków, powodować twardnienie osłonki przejrzystej i upośledzać zdolność implantacji zarodków [2-4]. Badania pokazują, że udane zapłodnienie oocytu ssaka następuje 20 minut po spotkaniu gamet [5]. Plemniki mogą przeniknąć przez wzgórek w ciągu 15 minut, a 80% oocytów może zostać zapłodnione, gdy zostaną wystawione na działanie dużej liczby plemników w ciągu 1 godziny[1]. Aby uniknąć możliwego szkodliwego wpływu długiej ekspozycji na plemniki na oocyty, opracowano protokół inseminacji z krótką współinkubacją. Oznacza to, że długotrwała koinkubacja oocytów i plemników może nie być konieczna, a nawet może być szkodliwa. Niektóre doniesienia sugerują, że czas ekspozycji plemników i oocytów wynoszący 1-6 godzin poprawia wyniki IVF[1,2,6,7]. Jednak inne badania nie wykazują takiej korzyści przy krótkim czasie inseminacji[8,9,10].

   Niedawno opublikowana metaanaliza wykazała[11], że krótka koinkubacja gamet wiązała się ze znacznie wyższym odsetkiem ciąż klinicznych (RR: 1,84, 95% CI: 1,24-2,73), trwająca ciąża (RR: 1,73, 95% CI: 1,27-2,33) i wyższy wskaźnik implantacji (RR: 1,80, 95% CI: 1,43-2,26) niż standardowa inseminacja. Ale wskaźniki normalnego zapłodnienia (RR: 0,98, 95% CI: 0,93-1,02), zarodki dobrej jakości (RR: 1,24, 95% CI: 1,0-1,53) i polispermii (RR: 0,84, 95% CI: 0,7-1,01) nie różniły się istotnie w porównaniu ze standardową inseminacją. W innej metaanalizie Cochrane[12] uwzględniono osiem RCT z udziałem 733 kobiet i uzyskano podobne wyniki. Ale odnotowano tylko kliniczny wskaźnik ciąż, wskaźnik trwających ciąż, który był znacznie wyższy w grupie z krótką koinkubacją niż w przypadku standardowej inseminacji. Jeśli chodzi o wskaźnik poronień, w jednym badaniu, obejmującym 167 kobiet, było sześć poronień. Te dane niskiej jakości sugerowały brak istotnej różnicy w prawdopodobieństwie poronienia między krótką koinkubacją a standardową inseminacją (OR 1,98, 95% CI 0,35 do 11,09; p = 0,44). Ponieważ w włączonych badaniach nie odnotowano żywych urodzeń, nie jest jasne, czy krótka koinkubacja poprawia wskaźnik żywych urodzeń w porównaniu ze standardowym protokołem nocnej inseminacji.

   Wady nieodłącznie związane z jakością tych badań, takie jak brak ukrycia alokacji i brak zaślepienia, ograniczają jakość dostępnych dowodów. Aby lepiej ocenić te kwestie, wymagane są bardziej dobrze zaprojektowane RCT, aby ocenić, czy krótka koinkubacja przyczyniłaby się do wyższego wskaźnika żywych urodzeń i niższego wskaźnika poronień w porównaniu ze standardowym protokołem nocnej inseminacji.

2. Cele:

   Celem niniejszego randomizowanego, kontrolowanego badania z podwójnie ślepą próbą jest porównanie skuteczności klinicznej (zwłaszcza w odniesieniu do wskaźnika urodzeń żywych) krótszej ekspozycji oocytu na plemniki w porównaniu ze standardową inkubacją u kobiet poddawanych zabiegowi IVF.

3. Projekt próbny:

Łącznie 280 niepłodnych kobiet poddawanych leczeniu IVF zostanie losowo przydzielonych do jednej z dwóch następujących grup za pomocą wygenerowanych komputerowo liczb losowych, które zostały umieszczone w zapieczętowanych kopertach:

Krótsza ekspozycja oocytu na grupę plemników: oocyty będą eksponowane na plemniki przez 2 godziny Standardowa grupa inkubacyjna: oocyty będą narażone na plemniki przez 20 godzin

Leczenie podmiotów

Wszystkie techniki zapłodnienia in vitro, w tym stymulacja jajników, będą zgodne z lokalnymi protokołami.

4.1 Stymulacja jajników i IVF

Wszystkie kobiety rozpoczęły leczenie IVF od stymulacji jajników, stosując protokoły długiego agonisty lub antagonisty. W przypadku protokołu długiego zostanie podany analog hormonu uwalniającego gonadotropiny (GnRHa) w celu odczulania przysadki, w 2-3 dniu cyklu miesiączkowego zostaną wykonane przezpochwowe badanie ultrasonograficzne oraz oznaczenie E2 w surowicy. Ludzka gonadotropina menopauzalna (hMG) lub rekombinowany FSH rozpocznie się od 150-300 IU dziennie na podstawie liczby pęcherzyków antralnych, wieku kobiet i wcześniejszej odpowiedzi jajników, zgodnie ze standardowymi procedurami operacyjnymi ośrodka. Odpowiedź jajników monitorowano za pomocą seryjnego skanowania przezpochwowego z monitorowaniem hormonalnym lub bez niego. Dalsze modyfikacje dawkowania będą oparte na odpowiedzi jajników według uznania lekarza prowadzącego. W przypadku protokołów antagonistów, antagonista (cetritide 0,25 mg dziennie) będą podawane w 6. dniu stymulacji jajników do dnia primingu hcg.

Gdy trzy wiodące pęcherzyki były ≥18 mm, podaje się 10 000 j.m. hCG lub 250 mg ovidrelu w celu wywołania ostatecznego dojrzewania oocytów. Pobranie oocytów zostanie zorganizowane około 36 godzin później.

4.2 Procedury inseminacyjne

Wszystkie próbki nasienia przygotowano zgodnie z konwencjonalną procedurą pływania. Po 2 godzinach od pobrania komórki jajowej każda dojrzała komórka jajowa zostanie zapłodniona około 50 000-100 000 ruchliwych plemników.

4.3. Przypisanie i maskowanie

W dniu OPU pacjenci zostaną losowo przydzieleni po pobraniu komórek jajowych przez technika laboratoryjnego zgodnie z wygenerowaną komputerowo listą randomizacyjną w zapieczętowanych kopertach do grupy krótszej inkubacji lub grupy kontrolnej. Do czasu zakończenia całego badania zarówno pacjenci, jak i klinicyści byli zaślepieni co do przydzielonej im grupy.

Ramię kontrolne Kobiety, które przydzieliły do ​​ramienia kontrolnego, wszystkie komórki jajowe zostaną wystawione na działanie plemników przez 20 godzin i sprawdzone pod kątem zapłodnienia w dniu 1 (20 godzin) po obnażeniu

Grupa interwencyjna W przypadku komórek przydzielonych do grupy interwencyjnej wszystkie oocyty zostaną poddane działaniu plemników przez 2 godziny i delikatnie przemyte przez dwie szalki zawierające 1,5 ml zrównoważonej pożywki, a następnie przeniesione do odpowiedniej mikrokropli zrównoważonej świeżej pożywki. Otaczająca komórka wzgórka zostanie zachowana, a nie usunięta z oocty.

4.4 Zapłodnienie i ocena zarodka Obie grupy oocytów zostaną udekorowane i sprawdzone pod kątem obecności dwóch przedjądrzy i dwóch ciałek kierunkowych w celu potwierdzenia zapłodnienia. Wszystkie inne wyniki (tj. Brak zapłodnienia, jedno przedjądrze, polispermia, degeneracja) również zostały zarejestrowane.

Morfologia zarodków będzie oceniana każdego dnia hodowli. Zarodki będą oceniane zgodnie z następującymi kryteriami. W skrócie, zarodki klasyfikuje się jako: stopień A, brak fragmentacji komórkowej; stopień B, fragmentacja <20%; klasa C, rozdrobnienie od 20% do 50%; i stopień D, fragmentacja >50%. Rejestrowano również liczbę blastomerów na zarodek. Zarodki klasy A i B stanowiły „zarodek dobrej jakości”.

Transfer jest wykonywany przez lekarza zespołu, przy czym maksymalnie 2 zarodki są zastępowane zgodnie ze standardowym protokołem pod kontrolą ultrasonografii przezbrzusznej. Wspomaganie fazy lutealnej jest podawane według uznania lekarza.

4.5 Kontynuacja strategii:

Test ciążowy zostanie wykonany 2 tygodnie po transferze zarodków na obu ramionach. Wszystkie kobiety, które uzyskają pozytywny wynik testu ciążowego 2 tygodnie po transferze świeżego zarodka, po kolejnych 5 tygodniach zostaną poddane USG przezpochwowemu w celu wykrycia obecności pęcherzyka ciążowego z sercem płodu, co oznacza trwającą ciążę.

Gromadzone będą dane dotyczące wszystkich wyników ciąży, w tym wczesnych poronień, takich jak poronienie lub ciąża pozamaciczna.

W celu osiągnięcia spójności w odniesieniu do zbierania wyników, w każdym ośrodku dla każdej kobiety zostaną wypełnione standardowe formularze opisów przypadków (CRF). Te CRF będą zawierać szczegółowe informacje na temat otrzymanego leczenia, wyników ciąży, powikłań w ciąży, sposobu porodu i wyników porodu.

Statystyka

5.1 Plan analizy: Czynniki demograficzne i cechy kliniczne zebrane w ramach zbierania danych wyjściowych zostaną podsumowane zliczeniami (procentami) dla zmiennych kategorycznych, średnią (odchylenie standardowe [SD]) dla zmiennych ciągłych o rozkładzie normalnym lub medianą (międzykwartylowy [IQR] lub cały zakres) dla innych zmiennych ciągłych.

Wyniki dla uczestników zostaną przeanalizowane w grupach, do których zostali przydzieleni, niezależnie od odchyleń od protokołu lub otrzymanego leczenia (zamiar leczenia). Porównawcza analiza statystyczna będzie obejmować obliczenie względnego ryzyka (RR) (95% CI) dla pierwszorzędowego punktu końcowego (99% CI dla wszystkich dychotomicznych wyników drugorzędowych), średniej różnicy (99% CI) dla ciągłych wyników drugorzędowych o rozkładzie normalnym lub mediany różnica (99% CI) dla skośnych zmiennych ciągłych.

Wszystkie analizy zostaną dostosowane pod kątem czynników minimalizacji, aby uwzględnić korelację między grupami leczenia wprowadzoną przez zrównoważenie randomizacji (która wymusza, aby wyniki między ramionami leczenia były podobne, z wyjątkiem jakiegokolwiek efektu leczenia).

Skorygowane współczynniki ryzyka zostaną oszacowane za pomocą modelu regresji logarytmicznej dwumianowej lub za pomocą modelu regresji logarytmicznej Poissona z solidnym estymatorem wariancji, jeśli model dwumianowy nie osiągnie zbieżności. Regresja liniowa zostanie zastosowana dla wyników o rozkładzie normalnym, a regresja kwantylowa dla skośnych zmiennych ciągłych.

Wstępnie określone analizy podgrup będą obejmowały przeniesienie stadium rozszczepiania w porównaniu do stadium blastocysty.

6. Oszacowanie wielkości próby:

Średni wskaźnik urodzeń żywych w naszym ośrodku w latach 2010-2012 wynosił 30% na transfer. Według niedawno opublikowanej Metaanalizy[11], krótka koinkubacja gamet wiązała się ze znacznie wyższym odsetkiem trwającej ciąży (RR: 1,73, 95% CI: 1,27-2,33) niż standardowa inseminacja.

Zakładając żywe urodzenia w grupie leczonej = 50% (wzrost o 70%); przy 90% mocy i dwustronnym 5% poziomie istotności statystycznej będziemy musieli zrekrutować 124 kobiety w każdym ramieniu. Aby uwzględnić 10% utratę do obserwacji, zrekrutujemy 140 osób w każdej grupie lub 280 osób do całego badania.

7. Ocena bezpieczeństwa

Wyniki niedawno opublikowanej metaanalizy[11,12] wykazały, że wskaźniki prawidłowego zapłodnienia, dobrej jakości zarodków i polispermii nie różniły się znacząco przy krótkim czasie inkubacji gamet w porównaniu ze standardową inseminacją. Dlatego w tym badaniu nie powinno być większych obaw dotyczących bezpieczeństwa.

8. Bezpośredni dostęp do danych źródłowych / dokumentów:

Dozwolone jest monitorowanie związane z badaniami, audyty, przeglądy IRB i kontrole regulacyjne.

9. Kontrola jakości i zapewnienie jakości

Pacjenci będą kierowani przez wymienionych badaczy, którzy mają odpowiednie doświadczenie w prowadzeniu leczenia wspomaganego rozrodu. Powołany zostanie Komitet Sterujący Procesem, który będzie nadzorował przebieg procesu.

10. Etyka

Od wszystkich pacjentów wymagana będzie pisemna zgoda. Załączono kartę informacyjną dla pacjenta i formularze zgody w języku angielskim i chińskim. Zgoda etyczna zostanie uzyskana od Institutional Review Board, pierwszego szpitala położniczego i niemowlęcego w Szanghaju.

11. Przetwarzanie danych i prowadzenie dokumentacji

Wszystkie dane będą przechowywane przez trzy lata. Wyznaczona pielęgniarka badawcza będzie odpowiedzialna za zarządzanie danymi, w tym kodowanie, monitorowanie i weryfikację danych.

12. Finansowanie i ubezpieczenie

Badanie zostanie sfinansowane przez MerckSerono China Research Fund for Fertility Experts.

13. Polityka wydawnicza

Wyniki tego badania zostaną przedłożone do rozpatrzenia w celu publikacji w recenzowanym czasopiśmie naukowym.

14. Suplementy

Badanie zostanie przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską i Dobrymi Praktykami Klinicznymi (ICH-GCP)