Исследование, сравнивающее более короткое воздействие ооцита со сперматозоидами по сравнению со стандартной инкубацией на уровень живорождения при лечении экстракорпоральным оплодотворением

1. Фон

   Метод экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) в настоящее время широко используется для лечения бесплодных пар. Чтобы получить лучшие результаты ЭКО, важно улучшить качество эмбрионов за счет оптимизации методов ЭКО. В процедурах ЭКО ооциты и сперматозоиды обычно совместно инкубируются в течение ночи, что может подвергнуть ооциты и зиготы субоптимальным условиям культивирования с повышенным содержанием активных форм кислорода (АФК), продуцируемых спермой в этой долгосрочной культуре [1]. Высокие уровни активных форм кислорода (АФК) могут отрицательно влиять на качество эмбрионов, приводить к отвердению блестящей оболочки и ухудшению способности эмбрионов к имплантации [2-4]. Исследования показывают, что успешное оплодотворение ооцита млекопитающего происходит через 20 минут после встречи гамет [5]. Сперматозоиды могут проникать через клетки кумулюса в течение 15 минут, а 80% ооцитов могут быть оплодотворены при контакте с большим количеством сперматозоидов в течение 1 часа [1]. В попытке избежать возможного пагубного воздействия на ооциты длительного воздействия спермы был разработан протокол краткосрочной коинкубационной инсеминации. Это означает, что длительная совместная инкубация ооцитов и сперматозоидов может быть необязательной и даже вредной. В некоторых сообщениях предполагается, что время воздействия сперматозоидов на яйцеклетку в течение 1-6 часов улучшает результаты ЭКО[1,2,6,7]. Однако другие исследования не сообщают о таком преимуществе при коротком времени осеменения[8,9,10].

   Недавно опубликованный мета-анализ показывает [11], что кратковременная совместная инкубация гамет была связана со значительно более высокими показателями клинической беременности (ОР: 1,84, 95% ДИ: 1,24-2,73). продолжающаяся беременность (ОР: 1,73, 95% ДИ: 1,27-2,33) и более высокая частота имплантации (ОР: 1,80, 95% ДИ: 1,43-2,26) чем стандартное осеменение. Но показатели нормального оплодотворения (ОР: 0,98, 95% ДИ: 0,93-1,02), эмбрионы хорошего качества (ОР: 1,24, 95% ДИ: 1,0-1,53) и полиспермия (ОР: 0,84, 95% ДИ: 0,7-1,01) существенно не отличались от стандартного осеменения. В другой Кокрановский мета-анализ[12] были включены восемь РКИ с участием 733 женщин, в которых были получены аналогичные результаты. Но в нем сообщалось только о частоте клинической беременности, частота продолжающейся беременности, которая была значительно выше в группе с краткой совместной инкубацией, чем при стандартном осеменении. Что касается частоты выкидышей, то в одном испытании, включавшем 167 женщин, было шесть выкидышей. Эти доказательства низкого качества предполагают отсутствие существенной разницы в шансах выкидыша между кратковременной совместной инкубацией и стандартным осеменением (ОШ 1,98, 95% ДИ от 0,35 до 11,09; P = 0,44). Во включенных исследованиях не сообщалось о живорождении, поэтому неясно, улучшает ли краткая совместная инкубация коэффициент рождаемости по сравнению со стандартным протоколом ночной инсеминации.

   Недостатки, присущие качеству этих исследований, такие как отсутствие сокрытия распределения и отсутствие ослепления, ограничивают качество имеющихся доказательств. Чтобы лучше оценить эти проблемы, необходимы более хорошо спланированные РКИ, чтобы оценить, будет ли кратковременная совместная инкубация способствовать более высокой частоте живорождения и более низкой частоте выкидышей по сравнению со стандартным протоколом ночной инсеминации.

2. Цели:

   Цель настоящего рандомизированного двойного слепого контролируемого исследования состоит в том, чтобы сравнить клиническую эффективность (особенно в отношении частоты живорождения) более короткого воздействия ооцита на сперматозоиды по сравнению со стандартной инкубацией у женщин, проходящих ЭКО.

3. Пробный дизайн:

В общей сложности 280 бесплодных женщин, проходящих лечение ЭКО, будут рандомизированы в одну из следующих двух групп с помощью сгенерированных компьютером случайных чисел, которые были помещены в запечатанные конверты:

Группа с более коротким воздействием сперматозоидов на ооциты: ооциты будут подвергаться воздействию сперматозоидов в течение 2 часов Стандартная группа инкубации: ооциты будут подвергаться воздействию сперматозоидов в течение 20 часов

Лечение субъектов

Все методы ЭКО, включая стимуляцию яичников, будут соответствовать местным протоколам.

4.1 Стимуляция яичников и ЭКО

Все женщины начинали лечение ЭКО со стимуляции яичников, используя протоколы длинного агониста или антагониста. Для длинного протокола будет назначен аналог гонадотропин-рилизинг-гормона (аГнРГ) для десенсибилизации гипофиза, на 2-3 день менструального цикла им будет проведено трансвагинальное ультразвуковое исследование и измерение уровня Е2 в сыворотке крови. Менопаузальный гонадотропин человека (ЧМГ) или рекомбинантный ФСГ будет начинаться со 150-300 МЕ в день в зависимости от количества антральных фолликулов, возраста женщин и предшествующей реакции яичников в соответствии со стандартными операционными процедурами центра. Реакцию яичников контролировали путем серийного трансвагинального сканирования с гормональным мониторингом или без него. Дальнейшие корректировки дозы будут основываться на реакции яичников по усмотрению лечащего врача. Для протоколов антагонистов антагонист (цетритид 0,25 мг ежедневно) будет вводиться с 6-го дня стимуляции яичников до дня праймирования ХГЧ.

Когда три лидирующих фолликула были ≥18 мм, вводят ХГЧ 10 000 МЕ или овидрел 250 мг, чтобы вызвать окончательное созревание ооцитов. Примерно через 36 часов будет организован забор ооцитов.

4.2 Процедуры осеменения

Все образцы спермы были приготовлены по стандартной процедуре всплытия. Через 2 часа после извлечения ооцитов каждый созревший ооцит будет осеменен примерно 50 000-100 000 подвижных сперматозоидов.

4.3. Назначение и маскировка

В день OPU пациенты будут рандомизированы после забора окоцитов лаборантом в соответствии с составленным компьютером списком рандомизации в запечатанных конвертах в группу с более коротким периодом инкубации или контрольную группу. До завершения всего исследования как пациенты, так и клиницисты не были осведомлены о назначенной группе.

Контрольная группа Женщины, отнесенные к контрольной группе, все ооциты подвергаются воздействию сперматозоидов в течение 20 часов и проверяются на оплодотворение в 1-й день (20 часов) после обнажения.

Группа вмешательства Для тех, кто отнесен к группе вмешательства, все ооциты будут подвергаться воздействию сперматозоидов в течение 2 часов и осторожно промываться через две чашки органов, содержащие 1,5 мл уравновешенной среды, а затем переносятся в соответствующие микрокапли уравновешенной свежей среды. Окружающие клетки кумулюса будут сохранены, а не удалены из яйцеклеток.

4.4 Оплодотворение и оценка эмбриона Обе группы ооцитов будут декоронированы и проверены на наличие двух пронуклеусов и двух полярных телец для подтверждения оплодотворения. Все остальные исходы (т. е. отсутствие оплодотворения, один пронуклеус, полиспермия, дегенерация) также регистрировались.

Морфологию эмбриона будут оценивать каждый день культивирования. Эмбрионы будут оцениваться в соответствии со следующими критериями. Вкратце, эмбрионы классифицируются как: класс А, отсутствие клеточной фрагментации; степень B, фрагментация <20%; степень C, фрагментация от 20% до 50%; и степень D,> 50% фрагментации. Регистрировали также количество бластомеров на эмбрион. Эмбрионы классов А и В представляли собой «эмбрионы хорошего качества».

Перенос осуществляется врачом бригады с заменой не более 2 эмбрионов в соответствии со стандартным протоколом под трансабдоминальным ультразвуковым контролем. Поддержка лютеиновой фазы проводится по усмотрению врача.

4.5 Последующая стратегия:

Тест на беременность будет проведен через 2 недели после переноса эмбрионов на обеих руках. Все женщины с положительным тестом на беременность через 2 недели после переноса свежего эмбриона будут подвергнуты трансвагинальному ультразвуковому сканированию еще через 5 недель, чтобы определить наличие плодного яйца с сердцем плода, что свидетельствует о продолжающейся беременности.

Будут собираться данные обо всех исходах беременности, включая потери на ранних сроках, такие как выкидыш или внематочная беременность.

Для обеспечения последовательности в отношении сбора результатов стандартные формы истории болезни (CRF) будут заполняться для каждой женщины в каждом центре. Эти ИРК будут включать подробную информацию о полученном лечении, исходах беременности, осложнениях беременности, способе родоразрешения и исходах родов.

Статистика

5.1 План анализа. Демографические факторы и клинические характеристики, собранные в рамках сбора исходных данных, будут суммированы с подсчетом (в процентах) для категориальных переменных, средним значением (стандартное отклонение [SD]) для нормально распределенных непрерывных переменных или медианой (межквартильный [IQR] или весь диапазон) для других непрерывных переменных.

Результаты для участников будут проанализированы в группах, к которым они относятся, независимо от отклонения от протокола или полученного лечения (намерение лечить). Сравнительный статистический анализ потребует расчета относительного риска (ОР) (95% ДИ) для основного результата (99% ДИ для всех дихотомических вторичных результатов), средней разницы (99% ДИ) для нормально распределенных непрерывных вторичных результатов или медианы разница (99% ДИ) для искаженных непрерывных переменных.

Все анализы будут корректироваться с учетом факторов минимизации, чтобы учесть корреляцию между группами лечения, введенную путем уравновешивания рандомизации (что приводит к тому, что результаты между группами лечения должны быть одинаковыми, за исключением любого эффекта лечения).

Скорректированные коэффициенты риска будут оцениваться с использованием модели логарифмической биномиальной регрессии или модели логарифмической регрессии Пуассона с надежной оценкой дисперсии, если биномиальная модель не сходится. Линейная регрессия будет использоваться для нормально распределенных результатов, а квантильная регрессия — для искаженных непрерывных переменных.

Предварительно указанные анализы подгрупп будут включать перенос стадии дробления в сравнении с переносом стадии бластоцисты.

6. Оценка размера выборки:

Средняя живорождаемость в нашем центре с 2010 по 2012 год составила 30% на один перевод. Согласно недавно опубликованному мета-анализу [11], кратковременная совместная инкубация гамет была связана со значительно более высокими показателями продолжающейся беременности (ОР: 1,73, 95% ДИ: 1,27–2,33). чем стандартное осеменение.

При условии живорождения в группе лечения = 50% (увеличение на 70%); при мощности 90% и двустороннем уровне статистической значимости 5% нам потребуется набрать по 124 женщины в каждую группу. Чтобы учесть 10% потери для последующего наблюдения, мы наберем 140 субъектов в каждой группе или 280 субъектов для всего исследования.

7. Оценка безопасности

Результаты недавно опубликованного мета-анализа [11,12] показали, что показатели нормального оплодотворения, эмбрионов хорошего качества и полиспермии существенно не отличались при короткой инкубации гамет по сравнению со стандартным осеменением. Таким образом, в этом исследовании не должно быть серьезных проблем с безопасностью.

8. Прямой доступ к исходным данным/документам:

Мониторинг, аудит, проверка IRB и инспекции регулирующих органов разрешены.

9. Контроль качества и обеспечение качества

Пациенты будут находиться под наблюдением перечисленных исследователей, которые имеют достаточный опыт проведения вспомогательных репродуктивных технологий. Будет сформирован судебный руководящий комитет, который будет контролировать проведение судебного разбирательства.

10. Этика

Письменное согласие будет получено от всех пациентов. Информационный лист пациента и формы согласия на английском и китайском языках прилагаются. Одобрение этики будет получено от Институционального наблюдательного совета Шанхайской первой больницы для беременных и младенцев.

11. Обработка данных и ведение записей

Все данные будут храниться в течение трех лет. Назначенная медсестра-исследователь будет отвечать за управление данными, включая кодирование данных, мониторинг и проверку.

12. Финансирование и страхование

Исследование будет финансироваться Китайским исследовательским фондом MerckSerono для экспертов по фертильности.

13. Политика публикации

Результаты этого исследования будут представлены на рассмотрение для публикации в рецензируемом научном журнале.

14. Добавки

Исследование будет проводиться в соответствии с Хельсинкской декларацией и надлежащей клинической практикой (ICH-GCP).