En studie som jämför en kortare exponering av oocyter för spermier jämfört med en standardinkubation på antalet levande födslar vid in vitro fertiliseringsbehandling

1. Bakgrund

   Teknik för in vitro fertilisering (IVF) används nu ofta för behandling av infertila par. För att få bättre resultat av IVF är det viktigt att förbättra embryonkvaliteten genom att optimera IVF-tekniker. Vid IVF-förfaranden saminkuberas oocyter och spermier rutinmässigt över natten, vilket kan exponera oocyter och zygoter för suboptimala odlingsförhållanden med ökade reaktiva syrearter (ROS) som produceras av spermier i denna långtidsodling[1]. Höga nivåer av reaktiva syrearter (ROS) kan påverka embryonas kvalitet negativt, resultera i förhårdnader av zona pellucida och försämra implantationskapaciteten hos embryon [2-4]. Studier visar att framgångsrik befruktning av en oocyt från däggdjur sker 20 minuter efter att könscellerna möts [5]. Spermier kan penetrera genom cumuluscellerna inom 15 minuter, och 80 % av oocyterna kan befruktas när de exponeras för ett stort antal spermier inom 1 timme[1]. Som ett försök att undvika möjliga skadliga effekter på oocyterna från lång exponering för spermier utvecklades det korta saminkubationsinseminationsprotokollet. Det innebär att långvarig saminkubation av oocyter och spermier kanske inte är nödvändig och kan till och med vara skadlig. Vissa rapporter tyder på att en exponeringstid för sperma-oocyter på 1-6 timmar förbättrar IVF-resultaten[1,2,6,7] Men andra studier rapporterar ingen sådan fördel med en kort inseminationstid[8,9,10].

   Nyligen publicerad metaanalys visar[11] kort saminkubation av könsceller var associerad med signifikant högre frekvens av kliniska graviditeter (RR: 1,84, 95 % KI: 1,24-2,73), pågående graviditet (RR: 1,73, 95 % KI: 1,27-2,33) och högre implantationshastighet (RR: 1,80, 95 % KI: 1,43-2,26) än vanlig insemination. Men graden av normal befruktning (RR: 0,98, 95 % KI: 0,93-1,02), embryon av god kvalitet (RR: 1,24, 95 % KI: 1,0-1,53) och polyspermi (RR: 0,84, 95 % KI: 0,7-1,01) var inte signifikant annorlunda jämfört med standardinsemination. I en annan Cochrane-metaanalys[12] inkluderades åtta RCT med 733 kvinnor och fick liknande resultat. Men det rapporterade bara klinisk graviditetsfrekvens, pågående graviditetsfrekvens som var signifikant högre i kort saminkubationsgrupp än standardinsemination. För missfallsfrekvensen var det sex missfall i ett försök inklusive 167 kvinnor. Dessa bevis av låg kvalitet antydde ingen signifikant skillnad i oddsen för missfall mellan kort saminkubation och standardinsemination (OR 1,98, 95 % CI 0,35 till 11,09; P = 0,44). Och levande födsel rapporterades inte i de inkluderade studierna, det är oklart om kort saminkubation förbättrar födelsetalen i livet jämfört med standardprotokollet för insemination över natten.

   Nackdelar som är inneboende i kvaliteten på dessa studier, såsom brist på allokeringsdöljande och ingen förblindande, begränsar kvaliteten på tillgängliga bevis. För att bättre utvärdera dessa frågor krävs mer väldesignade RCT för att bedöma om kort saminkubation skulle bidra till en högre födelsetal och en lägre missfallsfrekvens jämfört med standardprotokollet för insemination över natten.

2. Mål:

   Syftet med den nuvarande randomiserade, dubbelblindade kontrollerade studien är att jämföra den kliniska effektiviteten (särskilt på antalet levande födslar) av en kortare exponering av oocyter för spermier jämfört med en standardinkubation hos kvinnor som genomgår IVF-behandling.

3. Testdesign:

Totalt 280 infertila kvinnor som genomgår IVF-behandling kommer att randomiseras till en av följande två grupper genom datorgenererade slumptal som placerades i förseglade kuvert:

Kortare exponering av oocyter för spermiergrupp: oocyter kommer att exponeras för spermier i 2 timmar Standard inkubationsgrupp: oocyter kommer att exponeras för spermier i 20 timmar

Behandling av ämnen

Alla IVF-tekniker inklusive äggstocksstimulering kommer att vara enligt lokala protokoll.

4.1 Ovariestimulering och IVF

Alla kvinnor påbörjade sin IVF-behandling med äggstocksstimulering med antingen långagonist- eller antagonistprotokoll. För långt protokoll kommer gonadotropinfrisättande hormonanalog (GnRHa) att ges för hypofysdesensibilisering, på dag 2-3 av menstruationscykeln kommer de att genomgå transvaginal ultraljudsundersökning och serum E2-mätning. Humant menopausalt gonadotropin (hMG) eller rekombinant FSH kommer att börja med 150-300 IE per dag baserat på antalet antrala follikelar, kvinnors ålder och tidigare äggstockssvar, enligt standardoperationsprocedurerna för centret. Ovarialt svar övervakades genom seriell transvaginal skanning med eller utan hormonell övervakning. Ytterligare dosjusteringar kommer att baseras på äggstockssvaret enligt ansvarig läkares gottfinnande. För antagonistprotokoll, antagonist (cetritid 0,25 mg dagligen) kommer att ges den 6:e dagen av äggstocksstimulering fram till dagen för hcg-priming.

När tre ledande folliklar var ≥18 mm kommer hCG 10 000 IE eller ovidrel 250 mg att ges för att utlösa den slutliga mognad av oocyter. Oocythämtning kommer att ordnas cirka 36 timmar senare.

4.2 Inseminationsförfaranden

Alla spermaprover preparerades med det konventionella simningsförfarandet. Vid 2 timmar efter oocythämtning kommer varje mognad oocyt att insemineras med cirka 50 000-100 000 rörliga spermier.

4.3. Tilldelning och maskering

På dagen för OPU kommer patienter att randomiseras efter upptagning av occyter av en laboratorietekniker enligt en datorgenererad randomiseringslista i förseglade kuvert till den kortare inkubationsgruppen eller kontrollgruppen. Fram till slutförandet av hela studien var både patienterna och klinikerna blinda för den tilldelade gruppen.

Kontrollarm Kvinnor som tilldelats kontrollarmen, alla oocyter kommer att exponeras för spermier i 20 timmar och kontrolleras för befruktning på dag 1 (20 timmar) efter denudering

Interventionsarm För dem som tilldelats interventionsarmen kommer alla oocyter att exponeras för spermier i 2 timmar och sköljas försiktigt genom två organskålar innehållande 1,5 ml ekvilibrerat medium och överförs sedan till motsvarande mikrodroppe av ekvilibrerat färskt medium. Omgivande cumuluscell kommer att bevaras, inte tas bort från ooctyes.

4.4 Befruktning och embryoutvärdering Båda grupperna av oocyter kommer att dekoreras och kontrolleras med avseende på närvaron av två pronuklei och två polära kroppar för att bekräfta befruktningen. Alla andra utfall (d.v.s. ingen befruktning, en pronucleus, polyspermi, degeneration) registrerades också.

Embryomorfologi kommer att bedömas varje dag av odling. Embryon kommer att poängsättas enligt följande kriterier. Kortfattat klassificeras embryon som: grad A, ingen cellulär fragmentering; grad B, <20% fragmentering; grad C, 20 % till 50 % fragmentering; och grad D, >50 % fragmentering. Antalet blastomerer per embryo registrerades också. Embryon av grad A och B utgjorde embryot av god kvalitet.

Överföringen utförs av teamets läkare med maximalt 2 embryon som ersätts enligt standardprotokollet under transabdominal ultraljudsledning. Lutealfasstöd ges efter läkares bedömning.

4.5 Uppföljningsstrategi:

Ett graviditetstest kommer att utföras 2 veckor efter embryoöverföring i båda armarna. Alla kvinnor som har ett positivt graviditetstest 2 veckor efter en ny embryoöverföring kommer att genomgå en transvaginal ultraljudsundersökning efter ytterligare 5 veckor för att identifiera förekomsten av en dräktighetspåse med ett fosterhjärta som tyder på en pågående graviditet.

Data om alla graviditetsresultat inklusive tidiga graviditetsförluster som missfall eller utomkvedshavandeskap kommer att samlas in.

För att uppnå konsistens med avseende på insamlingen av utfall kommer standardiserade fallrapportformulär (CRF) att fyllas i för varje kvinna på varje center. Dessa CRF:er kommer att innehålla information om mottagen behandling, graviditetsresultat, komplikationer under graviditeten, förlossningssätt och förlossningsresultat.

Statistik

5.1 Analysplan: Demografiska faktorer och kliniska egenskaper som samlas in som en del av baslinjedatainsamlingen kommer att sammanfattas med räkningar (procentsatser) för kategoriska variabler, medelvärde (standardavvikelse [SD]) för normalfördelade kontinuerliga variabler, eller median (interkvartil [IQR] eller median). hela intervallet) för andra kontinuerliga variabler.

Resultaten för deltagarna kommer att analyseras i de grupper som de tilldelas oavsett avvikelse från protokollet eller mottagen behandling (intention-to-treat). Jämförande statistisk analys kommer att innebära att beräkna den relativa risken (RR) (95 % KI) för det primära utfallet (99 % KI för alla dikotoma sekundära utfall), medelskillnaden (99 % KI) för normalfördelade kontinuerliga sekundära utfall, eller medianen skillnad (99 % KI) för skeva kontinuerliga variabler.

Alla analyser kommer att justera för minimeringsfaktorerna för att ta hänsyn till korrelationen mellan behandlingsgrupper som introduceras genom att balansera randomiseringen (vilket tvingar utfallen mellan behandlingsarmarna att vara likartade bortsett från eventuell behandlingseffekt).

Justerade riskkvoter kommer att uppskattas med hjälp av en log binomial regressionsmodell, eller med en log Poisson regressionsmodell med en robust variansskattare om den binomala modellen inte konvergerar. Linjär regression kommer att användas för normalfördelade utfall och kvantilregression för skeva kontinuerliga variabler.

Fördefinierade undergruppsanalyser kommer att inkludera överföring av klyvning mot blastocyststadium.

6. Uppskattning av provstorlek:

Det genomsnittliga antalet levande födslar i vårt centrum från 2010-2012 var 30 % per överföring. Enligt nyligen publicerad metaanalys[11] var kort saminkubation av könsceller associerad med signifikant högre frekvens av pågående graviditet (RR: 1,73, 95 % KI: 1,27-2,33) än vanlig insemination.

Om man antar levande födsel i behandlingsgruppen =50% (ökning med 70%); med 90 % makt och en dubbelsidig nivå på 5 % av statistisk signifikans kommer vi att behöva rekrytera 124 kvinnor i varje arm. För att stå för 10 % förlust att följa upp kommer vi att rekrytera 140 försökspersoner i varje grupp eller 280 försökspersoner för hela studien.

7. Bedömning av säkerhet

Reults från nyligen publicerad metaanalys [11,12] visade att graden av normal befruktning, embryon av god kvalitet och polyspermi inte var signifikant annorlunda med korttidsinkubation av könsceller jämfört med standardinsemination. Därför bör det inte finnas några större säkerhetsproblem i denna studie.

8. Direkt åtkomst till källdata/dokument:

Försöksrelaterad övervakning, revisioner, IRB-granskning och myndighetsinspektioner är tillåtna.

9. Kvalitetskontroll och kvalitetssäkring

Patienterna kommer att hanteras av de listade utredarna som har tillräcklig erfarenhet av att hantera assisterade reproduktionsbehandlingar. En styrkommitté för försök kommer att bildas som kommer att övervaka genomförandet av rättegången.

10. Etik

Skriftligt medgivande kommer att erhållas från alla patienter. Patientinformationsbladet och samtyckesformulär på engelska och kinesiska bifogas. Etikgodkännande kommer att erhållas från Institutional Review Board, Shanghai First Maternity and Infant Health Hospital Hospital.

11. Datahantering och journalföring

All data kommer att lagras i tre år. En utsedd forskningssköterska kommer att ansvara för datahantering inklusive datakodning, övervakning och verifiering.

12. Finansiering och försäkring

Studien kommer att finansieras av MerckSerono China Research Fund for Fertility Experts.

13. Publiceringspolicy

Resultaten av denna studie kommer att lämnas in för övervägande för publicering i peer-reviewed vetenskaplig tidskrift.

14. Tillägg

Studien kommer att genomföras i enlighet med Helsingforsdeklarationen och god klinisk praxis (ICH-GCP)