En undersøgelse, der sammenligner en kortere eksponering af oocyt til spermatozoer versus en standardinkubation på frekvensen af ​​levende fødsel af in vitro fertiliseringsbehandling

1. Baggrund

   In vitro fertilisering (IVF) teknik er nu almindeligt anvendt til behandling af infertile par. For at opnå bedre resultater af IVF er det vigtigt at forbedre embryokvaliteten ved at optimere IVF-teknikker. I IVF-procedurer co-inkuberes oocytter og sæd rutinemæssigt natten over, hvilket kan udsætte oocytter og zygoter for suboptimale dyrkningsbetingelser med øgede reaktive oxygenarter (ROS) produceret af sæd i denne langtidskultur[1]. Høje niveauer af reaktive oxygenarter (ROS) kan påvirke kvaliteten af ​​embryonerne negativt, resultere i hærdning af zona pellucida og forringe implantationskapaciteten af ​​embryoner [2-4]. Undersøgelser viser, at en vellykket befrugtning af en pattedyrs oocyt finder sted 20 minutter efter kønsceller mødes [5]. Sædceller kan trænge gennem cumuluscellerne inden for 15 minutter, og 80 % af oocytterne kan befrugtes, når de udsættes for et stort antal spermatozoer inden for 1 time[1]. Som et forsøg på at undgå mulige skadelige virkninger på oocytterne fra langvarig eksponering for sæd, blev den korte co-inkubations-inseminationsprotokol udviklet. Det indebærer, at langvarig co-inkubation af oocytter og sædceller måske ikke er nødvendig og endda kan være skadelig. Nogle rapporter tyder på, at en sæd-oocyt-eksponeringstid på 1-6 timer forbedrer IVF-resultater[1,2,6,7] Men andre undersøgelser rapporterer ingen sådan fordel med en kort inseminationstid[8,9,10].

   Nylig publiceret metaanalyse viser[11] kort co-inkubation af kønsceller var forbundet med signifikant højere frekvenser af klinisk graviditet (RR: 1,84, 95 % CI: 1,24-2,73), igangværende graviditet (RR: 1,73, 95 % CI: 1,27-2,33) og højere implantationshastighed (RR: 1,80, 95 % CI: 1,43-2,26) end almindelig insemination. Men hastighederne for normal befrugtning (RR: 0,98, 95 % CI: 0,93-1,02), embryoner af god kvalitet (RR: 1,24, 95 % CI: 1,0-1,53) og polyspermi (RR: 0,84, 95 % CI: 0,7-1,01) var ikke signifikant anderledes sammenlignet med standardinsemination. I en anden Cochrane-metaanalyse[12] blev otte RCT'er med 733 kvinder inkluderet, og de fik lignende resultater. Men det rapporterede kun klinisk graviditetsrate, igangværende graviditetsrate, som var signifikant højere i kort co-inkubationsgruppe end standard insemination. For abortfrekvensen var der seks aborter i et forsøg, inklusive 167 kvinder. Denne evidens af lav kvalitet antydede ingen signifikant forskel i chancerne for abort mellem kort co-inkubation og standardinsemination (OR 1,98, 95 % CI 0,35 til 11,09; P = 0,44). Og levende fødsel blev ikke rapporteret i de inkluderede undersøgelser, det er uklart, om kort co-inkubation forbedrer livsfødselsraten sammenlignet med standard inseminationsprotokollen natten over.

   Ulemper forbundet med kvaliteten af ​​disse undersøgelser, såsom manglende tildelingsskjul og ingen blinding, begrænser kvaliteten af ​​den tilgængelige evidens. For bedre at kunne evaluere disse spørgsmål kræves mere veldesignede RCT'er for at vurdere, om kort co-inkubation ville bidrage til en højere levende fødselsrate og en lavere abortrate sammenlignet med standard inseminationsprotokol natten over.

2. Mål:

   Formålet med den nuværende randomiserede, dobbeltblindede kontrollerede undersøgelse er at sammenligne den kliniske effektivitet (især på levende fødselsrater) af en kortere eksponering af oocyter for sædceller sammenlignet med en standard inkubation hos kvinder, der gennemgår IVF-behandling.

3. Prøvedesign:

I alt 280 infertile kvinder, der gennemgår IVF-behandling, vil blive randomiseret i en af ​​følgende to grupper ved hjælp af computergenererede tilfældige tal, der blev lagt i forseglede kuverter:

Kortere eksponering af æg for sædceller: oocytter vil blive udsat for sædceller i 2 timer Standard inkubationsgruppe: oocytter vil blive udsat for sædceller i 20 timer

Behandling af emner

Alle IVF-teknikker inklusive ovariestimulering vil være i overensstemmelse med lokale protokoller.

4.1 Ovariestimulation og IVF

Alle kvinder startede deres IVF-behandling med ovariestimulering ved at bruge enten den lange agonist- eller antagonistprotokoll. For lang protokol vil gonadotropin-releasing hormon analog (GnRHa) blive givet til hypofyse desensibilisering, på dag 2-3 i menstruationscyklussen vil de gennemgå transvaginal ultralydsundersøgelse og serum E2 måling. Humant menopausalt gonadotropin (hMG) eller rekombinant FSH vil starte ved 150-300 IE pr. dag baseret på antral follikeltal, kvinders alder og tidligere ovarierespons i henhold til centrets standardoperationsprocedurer. Ovarierespons blev overvåget ved seriel transvaginal scanning med eller uden hormonmonitorering. Yderligere dosisjusteringer vil baseres på ovarieresponset efter de ansvarlige klinikeres skøn. For antagonistprotokoller, antagonist (cetritid 0,25 mg dagligt) vil blive givet på den 6. dag af ovariestimulation indtil dagen for hcg-priming.

Når tre førende follikler var ≥18 mm, vil hCG 10 000 IE eller ovidrel 250 mg blive givet for at udløse den endelige modning af oocytter. Oocytudtagninger vil blive arrangeret omkring 36 timer senere.

4.2 Inseminationsprocedurer

Alle sædprøver blev fremstillet ved den konventionelle svømme-op-procedure. 2 timer efter oocytudtagning vil hver modnet oocyt blive insemineret med ca. 50.000-100.000 bevægelige spermatozoer.

4.3. Tildeling og maskering

På dagen for OPU vil patienter blive randomiseret efter occyte-afhentning af en laboratorietekniker i henhold til en computergenereret randomiseringsliste i forseglede kuverter til den kortere inkubationsgruppe eller kontrolgruppen. Indtil afslutningen af ​​hele undersøgelsen var både patienterne og klinikerne blindet for den tildelte gruppe.

Kontrolarm Kvinder, der er allokeret til kontrolarmen, vil alle oocytterne blive udsat for spermatozoer i 20 timer og kontrolleret for befrugtning på dag 1 (20 timer) efter denudering

Interventionsarm For dem, der er allokeret til interventionsarmen, vil alle oocytterne blive eksponeret for spermatozoer i 2 timer og forsigtigt vasket gennem to organskåle indeholdende 1,5 ml ækvilibreret medium og derefter overført til den tilsvarende mikrodråbe ækvilibreret frisk medium. Omgivende cumulus-celle vil blive bibeholdt, ikke fjernet fra ooctyes.

4.4 Befrugtning og embryoevaluering Begge grupper af oocytter vil blive dekoreret og kontrolleret for tilstedeværelsen af ​​to pronuclei og to polære legemer for at bekræfte befrugtning. Alle andre udfald (dvs. ingen befrugtning, én pronucleus, polyspermi, degeneration) blev også registreret.

Embryomorfologi vil blive vurderet hver dag med dyrkning. Embryoer vil blive bedømt efter følgende kriterier. Kort fortalt klassificeres embryoner som: klasse A, ingen cellulær fragmentering; grad B, <20% fragmentering; grad C, 20% til 50% fragmentering; og grad D, >50 % fragmentering. Antallet af blastomerer pr. embryo blev også registreret. Grad A og B embryoner udgjorde "foster af god kvalitet".

Overførslen udføres af teamklinikeren med maksimalt 2 embryoner, der udskiftes i henhold til standardprotokollen under transabdominal ultralydsvejledning. Lutealfasestøtte gives efter lægens skøn.

4.5 Opfølgningsstrategi:

En graviditetstest vil blive udført 2 uger efter embryooverførsel i begge arme. Alle kvinder, der har en positiv graviditetstest 2 uger efter en frisk embryooverførsel, vil gennemgå en transvaginal ultralydsscanning efter yderligere 5 uger for at identificere tilstedeværelsen af ​​en svangerskabssæk med et føtalt hjerte, der indikerer en igangværende graviditet.

Data om alle graviditetsudfald, herunder tidlige graviditetstab, såsom abort eller ektopisk graviditet, vil blive indsamlet.

For at opnå konsistens med hensyn til indsamling af udfald, vil der blive udfyldt standardiserede sagsrapporter (CRF) for hver kvinde på hvert center. Disse CRF'er vil omfatte detaljer om modtaget behandling, graviditetsresultater, komplikationer under graviditeten, leveringsmåde og fødselsresultater.

Statistikker

5.1 Analyseplan: Demografiske faktorer og kliniske karakteristika indsamlet som en del af baseline dataindsamlingen vil blive opsummeret med tællinger (procenter) for kategoriske variabler, middelværdi (standardafvigelse [SD]) for normalfordelte kontinuerte variable eller median (interkvartil [IQR] eller median). hele området) for andre kontinuerte variable.

Resultaterne for deltagerne vil blive analyseret i de grupper, som de er tildelt uanset afvigelse fra protokollen eller modtaget behandling (intention-to-treat). Sammenlignende statistisk analyse vil indebære beregning af den relative risiko (RR) (95 % CI) for det primære udfald (99 % CI'er for alle dikotome sekundære udfald), den gennemsnitlige forskel (99 % CI) for normalfordelte kontinuerlige sekundære udfald eller medianen forskel (99 % CI) for skæve kontinuerte variable.

Alle analyser vil justere for minimeringsfaktorerne for at tage højde for sammenhængen mellem behandlingsgrupper introduceret ved at balancere randomiseringen (hvilket tvinger resultater mellem behandlingsarme til at være ens bortset fra enhver behandlingseffekt).

Justerede risikoforhold vil blive estimeret ved hjælp af en log binomial regressionsmodel eller ved hjælp af en log Poisson regressionsmodel med en robust variansestimator, hvis den binomiale model ikke konvergerer. Lineær regression vil blive brugt til normalfordelte udfald og kvantil regression for skæve kontinuerte variable.

Forudspecificerede undergruppeanalyser vil inkludere spaltning versus blastocyststadieoverførsel.

6. Estimeret prøvestørrelse:

Den gennemsnitlige levende fødselsrate i vores center fra 2010-2012 var 30 % pr. overførsel. Ifølge en nylig offentliggjort Meta-analyse[11] var kort co-inkubation af kønsceller forbundet med signifikant højere rater af igangværende graviditet (RR: 1,73, 95 % CI: 1,27-2,33) end almindelig insemination.

Forudsat levendefødte i behandlingsgruppen =50% (stigning med 70%); med 90 % magt og et tosidet 5 % niveau af statistisk signifikans bliver vi nødt til at rekruttere 124 kvinder i hver arm. For at tage højde for et tab på 10 % til opfølgning, vil vi rekruttere 140 forsøgspersoner i hver gruppe eller 280 forsøgspersoner til hele undersøgelsen.

7. Vurdering af sikkerhed

Resultater fra nyligt publiceret Meta-analyse[11,12] viste, at hastighederne for normal befrugtning, embryoner af god kvalitet og polyspermi ikke var signifikant forskellige med korttidsinkubation af gameter sammenlignet med standardinsemination. Der skulle således ikke være nogen større sikkerhedsproblemer i denne undersøgelse.

8. Direkte adgang til kildedata/dokumenter:

Forsøgsrelateret overvågning, revisioner, IRB-gennemgang og lovmæssige inspektioner er tilladt.

9. Kvalitetskontrol og kvalitetssikring

Patienterne vil blive behandlet af de anførte efterforskere, som har tilstrækkelig erfaring med at håndtere assisterede reproduktionsbehandlinger. Der vil blive dannet en prøvestyregruppe, som skal føre tilsyn med afviklingen af ​​forsøget.

10. Etik

Der vil blive indhentet skriftligt samtykke fra alle patienter. Patientinformationsbladet og samtykkeerklæringer på engelsk og kinesisk er vedlagt. Etisk godkendelse vil blive opnået fra Institutional Review Board, Shanghai First Maternity and Infant Health Hospital.

11. Datahåndtering og journalføring

Alle data vil blive opbevaret i tre år. En udpeget forskningssygeplejerske vil være ansvarlig for datahåndtering, herunder datakodning, overvågning og verifikation.

12. Finansiering og forsikring

Undersøgelsen vil blive finansieret af MerckSerono China Research Fund for Fertility Experts.

13. Udgivelsespolitik

Resultaterne af denne undersøgelse vil blive forelagt til overvejelse til offentliggørelse i peer-reviewed videnskabeligt tidsskrift.

14. Tillæg

Undersøgelsen vil blive udført i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen og god klinisk praksis (ICH-GCP)