探索自身免疫和干眼症的免疫细胞特征

1. 背景和理由

   1.1 总体介绍

   眼表疾病，尤其是干眼症和巩膜炎，通常影响患有自身免疫性疾病的患者。 眼表免疫细胞在自身免疫性疾病中增加；然而，激活的免疫细胞的完整子集是未知的。 最近的实验研究表明，角膜中的树突状细胞和 T 细胞与角膜神经支配密切相关。 角膜共聚焦显微镜 (CCM) 允许对树突状细胞和角膜神经进行快速非侵入性体内成像。 研究人员建议研究眼表健康、结膜免疫细胞和角膜神经/树突细胞形态在 3 种风湿病中如何相互作用：干燥综合征 (SS)、类风湿性关节炎 (RA)、系统性红斑狼疮 (SLE)。

   初步的流式细胞术研究表明，各种免疫细胞（例如：T 细胞、B 细胞和树突状细胞）可以使用微创印模膜 (Eyeprim) 进行量化。 在临床上，研究团队在使用 Oculus keratograph5M 测量眼表炎症特征（结膜发红、泪膜破裂时间）方面经验丰富。 研究人员还旨在使用印象细胞学收获结膜免疫细胞，并使用流式细胞术量化特定细胞类型。 将使用 CCM 评估角膜神经形态和树突状细胞密度和分布；与开创这项技术的小组合作。

   研究人员预计，角膜神经和树突状细胞参数的改变将与免疫激活/炎症、泪液功能恶化和风湿病的全身严重程度增加相关。 此外，研究者假设角膜神经密度越低，角膜树突状细胞和结膜炎症细胞的数量就越高。 研究这些关系可能有助于更好地了解局部角膜和全身免疫激活的机制，以及开发树突状细胞激活和神经纤维丢失的非侵入性眼科替代标记物，以帮助早期诊断、风险分层和我们新疗法的开发严重干眼症的自身免疫患者。

   1.2 研究目的的合理性

   干眼症是一种慢性眼表炎症，非常普遍，会导致角膜失明并造成严重的健康负担。 巩膜炎是与伴有或不伴有眼内炎症的巩膜轻度至重度炎症相关的眼表炎症性疾病。 严重的干眼症或巩膜炎与自身免疫性疾病如 SS、RA、SLE 和其他病症有关。 目前干眼症的治疗通常不够有效（例如，环孢菌素）或引起不良反应（例如，皮质类固醇诱发的青光眼）。 在自身免疫性干眼症中，眼表和泪腺存在免疫介导的损伤。 在干眼病的各种模型中，已经表明免疫系统的成分，如 T 细胞、巨噬细胞和细胞因子，如白细胞介素 (IL) 1β 和肿瘤坏死因子 (TNF)-α，对于引发和维持这种疾病至关重要. 同样，非感染性巩膜炎的治疗对所有葡萄膜炎专家来说都是一个非常具有挑战性的情况。

   当存在自身免疫性疾病时，眼表免疫细胞增加，特定类型免疫细胞的比例或数量，例如。 在更严重的局部炎症和/或全身活动存在的情况下，单核细胞或 CD4+ T 细胞可能会增加。 免疫细胞浸润的特征可能存在于特定的风湿病病症中。 如果某些类型的细胞（例如 T 细胞或 B 细胞）在全身性疾病中占主导地位，则表明可以使用 T 细胞方法（例如他克莫司）或 B 细胞方法（例如利妥昔单抗）。 或者，如果某些细胞因子在干眼症中起主要作用，则可以使用细胞因子信号转导抑制剂，例如 JAK 抑制剂。

   最近的研究表明，角膜中的树突状细胞和 T 细胞与角膜神经支配密切相关 [1, 2]。 这已在人类和动物研究中得到证实 [1-4]。 同时，近来人体角膜神经和树突状细胞的活体成像技术及其量化也有了很大的进步。 这导致人们对利用该技术作为周围神经病变的替代标志物并探索潜在机制的兴趣激增 [5-27]。 研究人员之前已经表明，第一代 CCM 可以量化糖尿病患者角膜 Bowman 层中朗格汉斯细胞 (LC) 的存在和密度 [28]。 然而，最新的第 3 代 HRT III 可用于将朗格汉斯细胞 (LC) 分类和量化为成熟表型（具有长突的树突细胞）或未成熟表型（缺乏细胞树突的非树突细胞），以深入了解免疫改变体内 [29]。 最近一项针对糖尿病小鼠的实验研究使用 CCM 表明 DC 与角膜神经之间的直接接触可能引发神经纤维损伤 [30]。

   科学知识差距：研究人员表明，干眼症患者的眼泪中促炎细胞因子升高；其中许多可能是由免疫细胞分泌的。 他们在初步的流式细胞术研究中发现，CD4+ T 细胞、CD19+ B 细胞、CD14+ 单核细胞、CD1c 树突状细胞可以使用微创印模膜 (Eyeprim) 进行定量[31]。 在干眼症和各种风湿病情况下，在眼表激活的免疫细胞的完整子集尚不清楚。 尚未评估这些细胞在不同严重程度的干眼症和不同全身活动的自身免疫性疾病中的比例。 此外，尚不确定角膜神经支配的完整性是否也是自身免疫系统性疾病患者泪液功能的决定因素。

   课题组开展了多项人体眼表临床试验和影像学研究。 这包括使用 Oculus 进行测量（非侵入性撕裂时间）、染色等，以及使用基于多重珠的夹心免疫荧光测定法测量细胞因子[32-38]

   初步研究 该研究小组还优化了结膜免疫细胞的 Eyeprim 收集和使用一组免疫标记物与 Amnis [31] 的分析方法，Amnis 是一种相对较新的流式细胞术（图 1），结合显微镜（图 2）。 Amnis 技术的优点是分析细胞的直接可视化以允许信号的共定位。 他们发表了关于使用 Amnis 软件进行细胞形态学参数分析与人类分级机相比的有效性 [31]。 此外，他们还使用传统的流式细胞术 (BD FACS) 来量化 CD3、CD4、CD8、CCR7、CXCR3、CD109 和 CD63 染色（数据未显示）。

   与 ENA 团队合作，他们的团队接受了使用 CCM 进行图像采集的培训，以实现角膜神经和树突状细胞的量化 [1、2、4、9、10、13、14、16、21、27]（图 3 ). 亚基底角膜神经纤维密度、角膜神经分支密度、角膜神经纤维长度和曲折度（图 3、4）将使用 ENA 团队开发的手动 (CCMetrics) 和自动 (ACCMetrics) 图像分析软件进行量化。 将量化与角膜神经相关的亚基底成熟和未成熟树突细胞密度和分布。

   合作者 Malik 教授和 Petropoulos 博士正在领导早期神经病变评估（ENA 团队-http://qatar-weill.cornell.edu/research/faculty/eng/index.html）并率先使用体内 CCM作为一种快速、无创的眼科仪器，用于监测糖尿病和其他周围神经病变。 他们将积极参与培训和监督最佳图像捕获，并将提供必要的软件和许可特权，以实现详细的量化和解释 [9、10、12-14、16、17、20、21、23-27]。

2. 假设和目标 总体长期目标：发现安全有效的眼表炎症治疗方法，并确定针对风湿病免疫系统的药物临床使用的眼表适应症。

   临床/医疗保健意义：在自身免疫性疾病中使用 CCM 有很多好处。 CCM 允许对角膜神经和树突状细胞进行快速、非侵入性成像，以确定炎症水平及其在自身免疫性疾病中的后果。 这将允许在风湿病诊所进行更早的诊断、风险分层和更及时的干预，加强对自身免疫患者的多学科护理。 研究者将通过使用本研究作为招募更多患者的平台来建立一个规范数据库（来自阅读中心的种族或当地年龄特定数据）。

   基础科学意义：促进对角膜神经与泪液功能/免疫学之间关系的理解。

   短期目标：研究人员提议与 Tan Tock Seng 医院合作开展一项全国性研究，以研究伴有或不伴有相关全身性自身免疫性疾病或胶原血管疾病的眼表炎症性疾病患者的临床特征和结膜免疫细胞。

   学术目标：旨在：

   • 加强 SERI 和 STIIC 的 S Albani 之间的多学科合作（细胞分析）
   • 建立新的合作关系（TTSH 眼科医生 R Agrawal 博士）
   • 从目前批准的资金中增加价值/协同作用：SERI 试点拨款（试点参与者的招募和工具的优化），
   • 竞争未来的资金、NMRC STAR 奖、CS 或 CBIRG。

   预期结果：

   • 风湿病的不同全身严重程度、干眼症状、泪液功能、NIKBUT 和角膜染色可能与角膜神经和树突状/非树突状细胞缺陷相关。
   • 泪液细胞因子可能与角膜神经和树突状/非树突状细胞缺陷相关。
   • T 细胞或其他细胞（例如结膜中的树突状细胞）的密度和亚型的变化（印迹细胞学）可能与角膜神经和树突状/非树突状细胞缺陷相关。

   2.3 潜在风险和收益： 2.3.1 潜在风险

   • 使用印模膜对结膜细胞进行取样时可能会有一些轻微的不适
   • 泪液收集引起的轻微不适或发红（Schirmer 测试）
   • 体内共聚焦显微镜很少会出现角膜上皮缺损，但这通常会在 1-2 天内愈合。 角膜上皮缺损是指一层角膜破裂，类似于擦伤时发生的情况。
   • 局部麻醉剂（Alcaine）引起的刺痛感

   2.3.2 潜在益处 随着对各种炎症介质存在的更深入了解，研究人员可以进一步了解发生在自身免疫性疾病患者身上的复杂过程。

3. 研究人群 3.1 列出要登记的受试者的数量和性质。 研究人员将招募具有 3 种特定风湿病诊断和控制的患者

   • SS (n=40)、RA (n=40)、SLE (n=40)
   • 健康年龄/种族/性别匹配的对照受试者 (n=40)

   总样本量：160

4. 研究设计 这是一项涉及 160 名参与者的横断面研究。 学习时间：一次访问，招聘时间：1年

4.1.1 筛选访问和程序筛选访问和程序将在单独的一天进行。 从 TTSH 推荐的参与者将被分配一个时间段来 SERI 进行眼科检查。 在手术当天，SERI 协调员将根据纳入和排除清单向他们提出一些问题，从而筛选符合条件的受试者。 如果发现符合条件并且参与者有兴趣，将在 SERI 获得同意，SERI 验光师将进行眼部评估。

4.1.2 学习程序

考试将由 SERI 研究小组成员完成。 所需考试清单如下所示：

1. 干眼症状（SPEED 问卷）
2. 无创撕裂时间 (NIKBUT) - Oculus K5M
3. 结膜发红- Oculus K5M
4. Schirmers 带的泪液收集
5. 印象细胞学-使用EyePrim结膜
6. 角膜荧光素染色 - Oculus K5M
7. 体内角膜共聚焦显微镜 (CCM)
8. 从参与者那里检索临床信息