自己免疫およびドライアイ症候群における免疫細胞の特徴を探る

1. 背景と根拠

   1.1 一般的な紹介

   眼表面疾患、特にドライアイと強膜炎は、一般的に自己免疫疾患の患者に影響を与えます。 自己免疫疾患では眼球表面の免疫細胞が増加します。ただし、活性化された免疫細胞の完全なサブセットは不明です。 最近の実験的研究は、角膜の樹状細胞と T 細胞が角膜神経支配と決定的に関連していることを示しています。 角膜共焦点顕微鏡 (CCM) は、樹状細胞と角膜神経の迅速な非侵襲的 in vivo イメージングを可能にします。 研究者らは、シェーグレン症候群 (SS)、関節リウマチ (RA)、全身性エリテマトーデス (SLE) の 3 つのリウマチ状態において、眼表面の健康状態、結膜免疫細胞、および角膜神経/樹状細胞の形態がどのように相互作用するかを調査することを提案しています。

   予備的なフローサイトメトリー研究では、低侵襲印象膜 (Eyeprim) を使用してさまざまな免疫細胞 (例: T 細胞、B 細胞、および樹状細胞) を定量できることが示されています。 臨床的には、研究チームは、Oculus keratograph5M を使用して眼表面の炎症の特徴 (結膜の発赤、涙液の分解時間) を測定した経験があります。 研究者はまた、インプレッション細胞診を使用して結膜免疫細胞を採取し、フローサイトメトリーで特定の細胞タイプを定量化することも目指しています。 角膜神経の形態と樹状細胞の密度と分布は、CCMを使用して評価されます。この技術を開拓したグループと協力して。

   研究者は、角膜神経および樹状細胞パラメーターの変化が、免疫活性化/炎症、涙液機能の低下、およびリウマチ性疾患の全身重症度の増加と相関すると予想しています。 さらに、研究者は、角膜神経密度が低いほど、角膜樹状細胞および結膜炎症細胞の数が多いという仮説を立てています。 これらの関係を研究することで、局所的な角膜および全身の免疫活性化の機械的理解が深まり、樹状細胞活性化および神経線維損失の非侵襲的な眼科代替マーカーの開発が可能になり、早期診断、リスク層別化、および新しい治療法の開発に役立つ可能性があります。重度のドライアイを伴う自己免疫患者。

   1.2 調査目的の合理性

   慢性的な眼表面の炎症の一種であるドライアイは、非常に蔓延しており、角膜失明の一因となり、深刻な健康上の負担を課しています。 強膜炎は、眼内炎症を伴うまたは伴わない強膜の軽度から重度の炎症に関連する眼表面の炎症性疾患です。 重度のドライアイまたは強膜炎は、SS、RA、SLE などの自己免疫疾患と関連しています。 ドライアイの現在の治療は、多くの場合、十分に効果的でないか (例えば、シクロスポリン)、または有害作用 (例えば、コルチコステロイド誘発性緑内障) を引き起こします。 自己免疫性ドライアイでは、目の表面と涙腺に免疫介在性損傷があります。 ドライアイ疾患のさまざまなモデルで、T 細胞、マクロファージ、インターロイキン (IL) 1β や腫瘍壊死因子 (TNF)-α などのサイトカインなどの免疫系の構成要素が、この疾患の誘発と維持に重要であることが示されています。 . 同様に、非感染性の強膜炎の治療は、すべてのぶどう膜炎の専門家にとって非常に困難な状況です。

   眼表面免疫細胞は、自己免疫疾患が存在する場合、特定のタイプの免疫細胞の割合または数のいずれかで増加します。 単球または CD4+ T 細胞は、より深刻な局所炎症および/または全身性活動の存在下で増加する可能性があります。 免疫細胞浸潤のサインは、特定のリウマチ状態に存在する可能性があります。 特定の種類の細胞 (例: T 細胞または B 細胞) が全身性疾患で優勢である場合、T 細胞アプローチ (例: タクロリムス) または B 細胞アプローチ (例: リツキサマブ) を使用できることが示唆されます。 あるいは、特定のサイトカインがドライアイで主要な役割を果たす場合、JAK阻害剤などのサイトカインシグナル伝達の阻害剤を使用することができます。

   最近の研究では、角膜の樹状細胞と T 細胞が角膜神経支配と決定的に関連していることが示されています [1、2]。 これは、人間と動物の両方の研究で示されています [1-4]。 同時に、ヒト角膜神経および樹状細胞の in vivo イメージングとその定量化の技術は、最近大幅に改善されました。 これにより、この技術を末梢神経障害の代理マーカーとして利用し、根底にあるメカニズムを探求することに関心が爆発的に高まっています [5-27]。 研究者らは以前に、第 1 世代 CCM が糖尿病患者の角膜ボーマン層のランゲルハンス細胞 (LC) の存在と密度を定量化できることを示しました [28]。 ただし、最新の第 3 世代 HRT III を使用して、ランゲルハンス細胞 (LC) を成熟表現型 (長いプロセスを持つ樹状細胞) または未成熟表現型 (細胞樹状突起を欠く非樹状細胞) に分類および定量化して、免疫変化に関する洞察を提供できます。生体内 [29]。 糖尿病マウスを対象とした最近の実験的研究では、CCM を使用して、DC と角膜神経の間の直接接触が神経線維の損傷を引き起こす可能性があることが示されました [30]。

   科学的知識のギャップ: 研究者は、炎症性サイトカインがドライアイのヒトの涙で上昇していることを示しました。これらの多くは、免疫細胞によって分泌される可能性があります。 彼らは、予備的なフローサイトメトリー研究で、CD4+ T 細胞、CD19+ B 細胞、CD14+ 単球、CD1c 樹状細胞が低侵襲印象膜 (Eyeprim) を使用して定量化できることを発見しました [31]。 ドライアイやさまざまなリウマチ状態で眼球表面で活性化される免疫細胞の完全なサブセットは知られていません。 ドライアイのさまざまな重症度および自己免疫疾患のさまざまな全身活動におけるこれらの細胞の割合は評価されていません。 さらに、角膜神経支配の完全性が全身性自己免疫疾患患者の涙液機能の決定因子でもあるかどうかは不明です。

   研究グループは、人間の眼球表面の多くの臨床試験と画像研究を行ってきました。 これには、Oculus (非侵襲的涙液分解時間)、染色などによる測定、およびマルチプレックス ビーズ ベースのサンドイッチ免疫蛍光アッセイを使用したサイトカインの測定が含まれます [32-38]。

   予備研究 研究グループは、結膜免疫細胞の Eyeprim コレクションと、Amnis による免疫マーカーのパネルを使用した分析方法も最適化しました [31]、比較的新しいタイプのフローサイトメトリー (図 1) と顕微鏡 (図 2) を組み合わせたものです。 アムニス技術の利点は、分析された細胞を直接可視化して、シグナルの共局在化を可能にすることです。 彼らは、人間のグレーダーと比較して、Amnis ソフトウェアを使用した細胞形態学的パラメーター分析の有効性について発表しました [31]。 さらに、従来のフローサイトメトリー (BD FACS) を使用して、CD3、CD4、CD8、CCR7、CXCR3、CD109、および CD63 染色を定量化しました (データは示していません)。

   ENA チームと協力して、彼らのチームは CCM を使用した画像取得のトレーニングを受け、角膜神経と樹状細胞の定量化を可能にしました [1、2、4、9、10、13、14、16、21、27] (図 3 ）。 基底下の角膜神経線維密度、角膜神経枝密度、角膜神経線維の長さおよびねじれ (図 3、4) は、ENA チームが開発した手動 (CCMetrics) および自動 (ACCMetrics) 画像解析ソフトウェアの両方を使用して定量化されます。 角膜神経に関連する基底下の成熟および未成熟樹状細胞の密度および分布が定量化されます。

   共同研究者であるマリク教授とペトロプロス博士は、早期神経障害評価 (ENA team-http://qatar-weill.cornell.edu/research/faculty/eng/index.html) を主導し、in vivo CCM の使用を開拓しました。糖尿病やその他の末梢神経障害を監視するための迅速で非侵襲的な眼科用器具として。 彼らは、最適な画像キャプチャのトレーニングと監督に積極的に取り組み、詳細な定量化と解釈を可能にするために必要なソフトウェアとライセンス特権を提供します [9、10、12-14、16、17、20、21、23-27]。

2. 仮説と目的 全体的な長期目標: 眼表面の炎症に対する安全で効果的な治療法を発見し、リウマチ性疾患における免疫系を標的とする医薬品の臨床使用に対する眼表面の適応を定義します。

   臨床/ヘルスケアへの影響: 自己免疫疾患で CCM を使用することには多くの利点があります。 CCM は、角膜神経と樹状細胞の迅速で非侵襲的なイメージングを可能にし、炎症のレベルと自己免疫疾患におけるその影響を判断します。 これにより、リウマチクリニックでの早期診断、リスク層別化、およびよりタイムリーな介入が可能になり、自己免疫患者の集学的ケアが強化されます。 治験責任医師は、より多くの患者を募集するためのプラットフォームとしてこの研究を使用して、標準データベース (読書センターからの民族または地域の年齢に固有のデータのいずれか) を構築します。

   基礎科学への影響: 角膜神経と涙液機能/免疫学との関係の理解を深めます。

   短期的な目標: 研究者は、関連する全身性自己免疫疾患またはコラーゲン血管疾患を伴うまたは伴わない眼表面炎症性疾患患者の臨床的特徴および結膜免疫細胞を研究するために、Tan Tock Seng 病院と共同で全国的な研究を提案しています。

   学問的目標: 目指す:

   • SERIとSTIICのS Albaniとの学際的なコラボレーションを強化（細胞分析）
   • 新しいコラボレーションの構築 (TTSH 眼科医 Dr R Agrawal)
   • 現在承認されている資金から価値/相乗効果を高める: SERI パイロット助成金 (パイロット参加者の募集とツールの最適化)、
   • 将来の資金調達、NMRC STAR 賞、CS または CBIRG を競います。

   期待される結果:

   • リウマチ性疾患、ドライアイの症状、涙機能、NIKBUT、および角膜染色のさまざまな全身重症度は、角膜神経および樹状細胞/非樹状細胞の欠陥と相関している可能性があります。
   • 涙のサイトカインは、角膜神経および樹状細胞/非樹状細胞の欠陥と相関している可能性があります。
   • T 細胞または結膜の樹状細胞などの他の細胞の密度およびサブタイプの変化 (印象細胞診) は、角膜神経および樹状細胞/非樹状細胞の欠陥と相関している可能性があります。

   2.3 潜在的なリスクと利点: 2.3.1 潜在的なリスク

   • インプレッションメンブレンを使用した結膜細胞のサンプリング中に、わずかな不快感が生じる可能性があります。
   • 涙液の収集によるわずかな不快感または発赤（シルマーテスト）
   • まれに、in vivo 共焦点顕微鏡による角膜上皮欠損が発生することがありますが、これは通常 1 ～ 2 日で治癒します。 角膜上皮欠損は、角膜の層が壊れていることを意味し、擦り傷の際に起こったことに例えられます。
   • 局所麻酔薬（アルカイン）の結果としての刺すような感覚

   2.3.2 潜在的な利点 さまざまな炎症性メディエーターの存在をより深く理解することで、研究者は自己免疫疾患患者で起こっている複雑なプロセスについてさらに洞察を得ることができます。

3. 研究集団 3.1 リスト 登録される被験者の数と性質。 研究者は、3つの特定のリウマチ診断とコントロールを持つ患者を募集します

   • SS (n=40)、RA (n=40)、SLE (n=40)
   • 健康な年齢/民族/性別が一致した対照被験者 (n=40)

   合計サンプル サイズ: 160

4. 研究デザイン これは、160 人の参加者を対象とした横断研究です。 調査期間：1回、募集期間：1年

4.1.1 検診受診と手続き 検診受診と手続きは別日に行います。 TTSH から紹介された参加者には、眼科検査のために SERI に来る時間枠が割り当てられます。 手続き当日、SERIコーディネーターは、包含および除外チェックリストに基づいていくつかの質問をすることにより、適格な被験者をスクリーニングします. 適格であることが判明し、参加者が興味を持っている場合は、SERI で同意が得られ、SERI 検眼医が眼の評価を進めます。

4.1.2 試験手順

試験は SERI 研究チームのメンバーによって行われます。 必要な検査のリストは次のとおりです。

1. ドライアイの症状（SPEEDアンケート）
2. 非侵襲的涙液分解時間 (NIKBUT) - Oculus K5M
3. 結膜充血 - Oculus K5M
4. シルマーストリップからの涙液採取
5. Impression Cytology - EyePrim 結膜膜を使用
6. 角膜フルオレセイン染色 - Oculus K5M
7. 生体内角膜共焦点顕微鏡 (CCM)
8. 参加者からの臨床情報の検索