Изучение сигнатур иммунных клеток при аутоиммунитете и синдроме сухого глаза

1. ПРЕДПОСЫЛКИ И ОБОСНОВАНИЕ

   1.1 Общее введение

   Заболевания глазной поверхности, особенно синдром сухого глаза и склерит, обычно возникают у пациентов с аутоиммунными заболеваниями. Иммунные клетки поверхности глаза увеличиваются при аутоиммунных заболеваниях; однако полное подмножество активированных иммунных клеток неизвестно. Недавние экспериментальные исследования показывают, что дендритные клетки и Т-клетки в роговице критически связаны с иннервацией нервов роговицы. Конфокальная микроскопия роговицы (ККМ) позволяет проводить быструю неинвазивную визуализацию дендритных клеток и нервов роговицы in vivo. Исследователи предлагают исследовать, как здоровье поверхности глаза, конъюнктивальные иммунные клетки и морфология роговичных нервов/дендритных клеток взаимодействуют при 3 ревматологических заболеваниях: синдром Шегрена (СС), ревматоидный артрит (РА), системная красная волчанка (СКВ).

   Предварительные проточные цитометрические исследования показывают, что различные иммунные клетки (например, Т-клетки, В-клетки и дендритные клетки) могут быть количественно определены с использованием минимально инвазивных импрессионных мембран (Eyeprim). Клинически исследовательская группа имеет опыт измерения признаков воспаления поверхности глаза (покраснение конъюнктивы, время разрыва слезы) с помощью кератографа Oculus5M. Исследователи также стремятся собрать иммунные клетки конъюнктивы с помощью импрессионной цитологии и количественно определить определенные типы клеток с помощью проточной цитометрии. Морфологию нерва роговицы, плотность и распределение дендритных клеток будут оценивать с помощью CCM; в сотрудничестве с группой, которая впервые разработала эту технику.

   Исследователи предполагают, что изменения в параметрах нерва роговицы и дендритных клеток будут коррелировать с иммунной активацией/воспалением, ухудшением функции слезы и повышенной системной тяжестью ревматологического заболевания. Кроме того, исследователи предполагают, что чем ниже плотность нервов роговицы, тем выше количество дендритных клеток роговицы и клеток воспаления конъюнктивы. Изучение этих взаимосвязей может позволить лучше понять механизм локальной активации роговицы и системного иммунитета, а также разработать неинвазивный офтальмологический суррогатный маркер активации дендритных клеток и потери нервных волокон, чтобы помочь в более ранней диагностике, стратификации риска и разработке новых методов лечения в нашей аутоиммунные пациенты с выраженной сухостью глаз.

   1.2 Обоснование цели исследования

   Сухость глаз, тип хронического воспаления поверхности глаза, широко распространена и способствует слепоте роговицы и налагает серьезное бремя на здоровье. Склерит представляет собой воспалительное заболевание поверхности глаза, связанное с воспалением склеры от легкой до тяжелой степени с внутриглазным воспалением или без него. Тяжелая форма сухости глаз или склерит связана с аутоиммунными заболеваниями, такими как СС, РА, СКВ и другими состояниями. Существующие методы лечения сухости глаз часто недостаточно эффективны (например, циклоспорин) или вызывают побочные эффекты (например, глаукома, вызванная кортикостероидами). При аутоиммунной сухости глаз происходит иммунно-опосредованное повреждение глазной поверхности и слезной железы. На различных моделях синдрома сухого глаза было показано, что компоненты иммунной системы, такие как Т-клетки, макрофаги и цитокины, такие как интерлейкин (ИЛ) 1β и фактор некроза опухоли (ФНО)-α, имеют решающее значение для запуска и поддержания этого заболевания. . Точно так же лечение неинфекционных склеритов представляет собой очень сложную ситуацию для всех специалистов по увеитам.

   Иммунные клетки поверхности глаза увеличиваются, когда присутствует аутоиммунное заболевание, либо пропорция, либо количество иммунных клеток определенного типа, например. моноциты или CD4+ Т-клетки могут быть увеличены при наличии более тяжелого местного воспаления и/или системной активности. Признак инфильтрации иммунными клетками может присутствовать при определенном ревматологическом заболевании. Если при системном заболевании преобладают определенные типы клеток (например, Т-клетки или В-клетки), можно использовать Т-клеточный подход (например, такролимус) или В-клеточный подход (например, ритуксамаб). В качестве альтернативы, если определенные цитокины играют основную роль в синдроме сухого глаза, можно использовать ингибитор передачи сигналов цитокинов, такой как ингибитор JAK.

   Недавние исследования показали, что дендритные клетки и Т-клетки в роговице критически связаны с иннервацией роговичного нерва [1, 2]. Это было показано в исследованиях как на людях, так и на животных [1-4]. В то же время технология визуализации in vivo нервов и дендритных клеток роговицы человека и их количественная оценка в последнее время значительно улучшились. Это привело к взрыву интереса к использованию этой технологии в качестве суррогатного маркера периферических невропатий и к изучению лежащих в их основе механизмов [5-27]. Исследователи ранее показали, что СКК первого поколения могут количественно определять наличие и плотность клеток Лангерганса (ЛК) в слое Боумена роговицы у пациентов с диабетом [28]. Однако HRT III последнего поколения 3-го поколения можно использовать для классификации и количественного определения клеток Лангерганса (LC) по зрелому фенотипу (дендритные клетки с длинными отростками) или незрелому фенотипу (недендритные клетки без клеточных дендритов), чтобы получить представление об иммунных изменениях в организме. естественных условиях [29]. Недавнее экспериментальное исследование на мышах с диабетом использовало CCM, чтобы показать, что прямой контакт между DCs и нервами роговицы может вызвать повреждение нервных волокон [30].

   Пробел в научных знаниях: исследователи показали, что провоспалительные цитокины повышены в слезах людей с синдромом сухого глаза; многие из них могут секретироваться иммунными клетками. В предварительных проточных цитометрических исследованиях они обнаружили, что CD4+ Т-клетки, CD19+ В-клетки, CD14+ моноциты, CD1c дендритные клетки могут быть количественно определены с использованием минимально инвазивных импрессионных мембран (Eyeprim) [31]. Полное подмножество иммунных клеток, активируемых на поверхности глаза при синдроме сухого глаза и при различных ревматологических состояниях, неизвестно. Доли этих клеток при различной степени тяжести синдрома сухого глаза и различной системной активности аутоиммунного заболевания не оценивались. Кроме того, неясно, является ли целостность иннервации роговицы определяющим фактором функции слезы у пациентов с аутоиммунным системным заболеванием.

   Исследовательская группа провела множество клинических испытаний и визуализирующих исследований поверхности глаза человека. Сюда входят измерения с помощью Oculus (неинвазивное время разрыва слезы), окрашивание и т. д., а также измерение цитокинов с использованием сэндвич-анализа иммунофлуоресценции на основе мультиплексных шариков [32-38].

   Предварительные исследования Исследовательская группа также оптимизировала коллекцию конъюнктивальных иммунных клеток Eyeprim и метод анализа с использованием панели иммунных маркеров с Amnis [31], относительно нового типа проточной цитометрии (рис. 1) в сочетании с микроскопией (рис. 2). Преимуществом метода Amnis является прямая визуализация анализируемых клеток, позволяющая совместно локализовать сигналы. Они опубликовали данные о достоверности анализа морфологических параметров клеток с использованием программного обеспечения Amnis по сравнению с человеческим оценщиком [31]. Кроме того, они также использовали обычную проточную цитометрию (BD FACS) для количественного определения окрашивания CD3, CD4, CD8, CCR7, CXCR3, CD109 и CD63 (данные не показаны).

   В сотрудничестве с командой ENA их группа прошла обучение получению изображений с использованием CCM, чтобы обеспечить количественную оценку нервов роговицы и дендритных клеток [1, 2, 4, 9, 10, 13, 14, 16, 21, 27] (рис. 3). ). Плотность суббазальных нервных волокон роговицы, плотность ветвей нервных волокон роговицы, длина и извилистость нервных волокон роговицы (рис. 3, 4) будут количественно определены с использованием как ручного (CCMetrics), так и автоматизированного (ACCMetrics) программного обеспечения для анализа изображений, разработанного командой ENA. Будет количественно определена суббазальная плотность зрелых и незрелых дендритных клеток и их распределение по отношению к нервам роговицы.

   Соавторы, профессор Малик и доктор Петропулос, возглавляют оценку ранней невропатии (команда ENA-http://qatar-weill.cornell.edu/research/faculty/eng/index.html) и впервые применили СКК in vivo. в качестве быстрого неинвазивного офтальмологического инструмента для мониторинга диабетической и других периферических невропатий. Они будут активно участвовать в обучении и надзоре за оптимальным захватом изображений и предоставят необходимое программное обеспечение и лицензионные привилегии для обеспечения детальной количественной оценки и интерпретации [9, 10, 12-14, 16, 17, 20, 21, 23-27].

2. ГИПОТЕЗА И ЦЕЛИ Общая долгосрочная цель: открыть безопасное и эффективное лечение воспаления поверхности глаза и определить показания для клинического применения препаратов, воздействующих на иммунную систему, при ревматологических заболеваниях.

   Клинические/медицинские последствия: использование СКМ при аутоиммунных заболеваниях дает много преимуществ. CCM позволяет проводить быструю неинвазивную визуализацию нервов роговицы и дендритных клеток для определения уровня воспаления и его последствий при аутоиммунных заболеваниях. Это позволит более раннюю диагностику, стратификацию риска и более своевременное вмешательство в ревматологических клиниках, улучшив междисциплинарную помощь пациентам с аутоиммунными заболеваниями. Исследователь создаст нормативную базу данных (этнические или местные возрастные данные из центра чтения), используя это исследование в качестве платформы для набора большего количества пациентов.

   Последствия для фундаментальной науки: более глубокое понимание взаимосвязи между нервами роговицы и функцией слезы/иммунологией.

   Краткосрочные цели: исследователи предлагают провести общенациональное исследование в сотрудничестве с больницей Тан Ток Сенг для изучения клинических особенностей и иммунных клеток конъюнктивы у пациентов с воспалительным заболеванием глазной поверхности с сопутствующим системным аутоиммунным или коллагеновым заболеванием сосудов или без него.

   Академические цели: Цель:

   • Расширение междисциплинарного сотрудничества между SERI и S Albani из STIIC (анализ клеток)
   • Создание нового сотрудничества (офтальмолог TTSH д-р Р. Агравал)
   • Увеличить ценность/синергию за счет утвержденного в настоящее время финансирования: пилотный грант SERI (набор участников пилотного проекта и оптимизация инструментов),
   • Соревнуйтесь за будущее финансирование, награду NMRC STAR, CS или CBIRG.

   Ожидаемые результаты:

   • Различная системная тяжесть ревматологических заболеваний, симптомы сухости глаз, нарушение функции слезы, NIKBUT и окрашивание роговицы могут коррелировать с дефектами роговичных нервов и дендритных/недендритных клеток.
   • Цитокины слезы могут коррелировать с дефектами роговичного нерва и дендритных/недендритических клеток.
   • Изменение плотности и подтипов Т-клеток или других клеток, таких как дендритные в конъюнктиве (импрессионная цитология), может коррелировать с дефектами роговичного нерва и дендритных/недендритных клеток.

   2.3 Потенциальные риски и преимущества: 2.3.1 Потенциальные риски

   • Возможно, что при заборе клеток конъюнктивы с помощью оттискной мембраны может возникнуть небольшой дискомфорт.
   • Небольшой дискомфорт или покраснение из-за скопления слезной жидкости (проба Ширмера)
   • В редких случаях при конфокальной микроскопии in vivo может наблюдаться дефект эпителия роговицы, но обычно он заживает через 1-2 дня. Дефект эпителия роговицы означает, что слой роговицы поврежден, подобно тому, что произошло во время ссадины.
   • Ощущение жжения в результате местного анестетика (алкаин)

   2.3.2 Потенциальные преимущества Благодаря лучшему пониманию присутствия различных медиаторов воспаления исследователи могут лучше понять сложный процесс, происходящий у пациентов с аутоиммунными заболеваниями.

3. ИССЛЕДУЕМАЯ ГРУППА 3.1 Перечислите количество и характер субъектов, которые будут зачислены. Исследователи будут набирать пациентов с 3 конкретными ревматологическими диагнозами и контролем.

   • СС (n=40), РА (n=40), СКВ (n=40)
   • Здоровые контрольные субъекты по возрасту/этнической принадлежности/полу (n=40)

   Общий размер выборки: 160

4. ДИЗАЙН ИССЛЕДОВАНИЯ Это перекрестное исследование с участием 160 человек. Продолжительность обучения: одно посещение, продолжительность набора: 1 год

4.1.1 Скрининговый визит и процедуры Скрининговый визит и процедуры будут проводиться в отдельный день. Участникам, направленным из TTSH, будет выделено время для прибытия в SERI для осмотра глаз. В день процедуры координатор SERI проверит подходящих субъектов, задав им несколько вопросов на основе контрольного списка включения и исключения. Если будет установлено, что они соответствуют требованиям и участники заинтересованы, в SERI будет получено согласие, и оптометрист SERI приступит к оценке глаз.

4.1.2 Процедуры исследования

Экзамены будут проводиться членами исследовательской группы SERI. Список необходимых обследований представлен:

1. Симптомы сухости глаз (опросник SPEED)
2. Неинвазивное время разрыва слезы (NIKBUT) — Oculus K5M
3. Покраснение конъюнктивы — Oculus K5M
4. Сбор слезы из полоски Ширмерса
5. Импрессионная цитология с использованием конъюнктивальных мембран EyePrim
6. Окрашивание роговицы флуоресцеином — Oculus K5M
7. Конфокальная микроскопия роговицы in vivo (CCM)
8. Получение клинической информации от участников