자가면역 및 안구건조증에서 면역 세포 시그니처 탐색

1. 배경 및 근거

   1.1 일반 소개

   안구 표면 질환, 특히 안구건조증 및 공막염은 일반적으로 자가면역 질환 환자에게 영향을 미칩니다. 안구 표면 면역 세포는 자가면역 질환에서 증가합니다. 그러나 활성화된 면역 세포의 전체 하위 집합은 알려져 있지 않습니다. 최근 실험 연구에 따르면 각막의 수지상 세포와 T 세포는 각막 신경 분포와 결정적으로 연관되어 있습니다. 각막 공초점 현미경(CCM)은 수지상 세포와 각막 신경의 빠른 비침습 생체 내 이미징을 가능하게 합니다. 조사자들은 안구 표면 건강, 결막 면역 세포 및 각막 신경/수지상 세포 형태가 3가지 류마티스 상태: 쇼그렌 증후군(SS), 류마티스 관절염(RA), 전신성 홍반성 루푸스(SLE)에서 어떻게 상호 작용하는지 조사할 것을 제안합니다.

   예비 유세포 분석 연구는 다양한 면역 세포(예: T 세포, B 세포 및 수지상 세포)가 최소 침습 인상막(Eyeprim)을 사용하여 정량화될 수 있음을 보여줍니다. 임상적으로 연구팀은 Oculus keratograph5M으로 안구 표면 염증의 특징(결막 충혈, 눈물파괴 시간)을 측정한 경험이 있다. 연구자들은 또한 인상 세포학을 사용하여 결막 면역 세포를 수확하고 유세포 분석기로 특정 세포 유형을 정량화하는 것을 목표로 합니다. 각막 신경 형태와 수지상 세포 밀도 및 분포는 CCM을 사용하여 평가됩니다. 이 기술을 개척한 그룹과 협력하여.

   연구자들은 각막 신경 및 수지상 세포 매개변수의 변경이 면역 활성화/염증, 눈물 기능 저하 및 류마티스 질환의 전신 중증도 증가와 관련이 있을 것으로 예상합니다. 또한 연구자는 각막 신경 밀도가 낮을수록 각막 수지상 세포와 결막 염증 세포의 수가 더 많다는 가설을 세웠습니다. 이러한 관계를 연구하면 국소 각막 및 전신 면역 활성화에 대한 더 나은 기계론적 이해와 수지상 세포 활성화 및 신경 섬유 손실의 비침습성 안과용 대리 마커를 개발하여 조기 진단, 위험 계층화 및 새로운 치료법 개발에 도움이 될 수 있습니다. 안구건조증이 심한 자가면역 환자.

   1.2 연구 목적의 합리적

   만성 안구 표면 염증의 일종인 안구건조증은 매우 널리 퍼져 있으며 각막 실명에 기여하고 심각한 건강 부담을 부과합니다. 공막염은 안내 염증을 동반하거나 동반하지 않는 공막의 경증 내지 중증 염증과 관련된 안구 표면 염증 장애이다. 심한 안구 건조증 또는 공막염은 SS, RA, SLE 및 기타 상태와 같은 자가면역 질환과 관련이 있습니다. 안구 건조증의 현재 치료는 종종 충분히 효과적이지 않거나(예: 사이클로스포린) 부작용을 유발합니다(예: 코르티코스테로이드 유발 녹내장). 자가면역성 안구건조증은 안구 표면과 눈물샘에 면역 매개 손상이 있습니다. 안구 건조증의 다양한 모델에서 T 세포, 대식세포 및 인터루킨(IL) 1β 및 종양 괴사 인자(TNF)-α와 같은 사이토카인과 같은 면역 체계의 구성 요소가 이 질병을 유발하고 유지하는 데 중요하다는 것이 밝혀졌습니다. . 마찬가지로 비감염성 공막의 치료는 모든 포도막염 전문의에게 매우 어려운 상황입니다.

   안구 표면 면역 세포는 자가면역 질환이 존재할 때 증가하며, 특정 유형의 면역 세포의 비율 또는 수입니다. 단핵구 또는 CD4+ T 세포는 더 심한 국소 염증 및/또는 전신 활동이 있을 때 증가할 수 있습니다. 면역 세포 침윤의 징후는 특정 류마티스 상태에 존재할 수 있습니다. 특정 유형의 세포(예: T 세포 또는 B 세포)가 전신 질환에서 우세한 경우 T 세포 접근법(예: tacrolimus) 또는 B 세포 접근법(예: rituxamab)을 사용할 수 있음을 시사합니다. 또는 특정 사이토카인이 안구 건조증에 중요한 역할을 하는 경우 JAK 억제제와 같은 사이토카인 신호 억제제를 사용할 수 있습니다.

   최근 연구에 따르면 각막의 수지상 세포와 T 세포는 각막 신경 분포와 결정적으로 관련되어 있습니다[1, 2]. 이것은 인간과 동물 연구 모두에서 나타났습니다[1-4]. 동시에 인간 각막 신경과 수지상 세포의 생체 내 이미징 및 정량화 기술이 최근 크게 향상되었습니다. 이로 인해 이 기술을 말초 신경병증의 대리 마커로 활용하고 기본 메커니즘을 탐색하는 데 대한 관심이 폭발적으로 증가했습니다[5-27]. 연구자들은 이전에 1세대 CCM이 당뇨병 환자의 각막 보우만 층에 있는 랑게르한스 세포(LC)의 존재와 밀도를 정량화할 수 있음을 보여주었습니다[28]. 그러나 최신 3세대 HRT III를 사용하여 랑게르한스 세포(LC)를 성숙한 표현형(긴 돌기가 있는 수지상 세포) 또는 미성숙 표현형(세포 수상돌기가 없는 비수지상 세포)으로 분류하고 정량화하여 면역 변화에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 생체 [29]. 당뇨병 마우스에 대한 최근 실험 연구는 DC와 각막 신경 사이의 직접적인 접촉이 신경 섬유 손상을 유발할 수 있음을 보여주기 위해 CCM을 사용했습니다[30].

   과학적 지식의 격차: 연구원들은 안구 건조증이 있는 사람의 눈물에서 전염증성 사이토카인이 증가한다는 것을 보여주었습니다. 이들 중 다수는 면역 세포에 의해 분비될 수 있습니다. 그들은 예비 유세포 분석 연구에서 CD4+ T 세포, CD19+ B 세포, CD14+ 단핵구, CD1c 수지상 세포가 최소 침습 인상막(Eyeprim)을 사용하여 정량화될 수 있음을 발견했습니다[31]. 안구 건조증 및 다양한 류마티스 질환에서 안구 표면에서 활성화된 면역 세포의 전체 하위 집합은 알려져 있지 않습니다. 안구건조증의 중증도와 자가면역질환의 전신 활성도가 다른 이들 세포의 비율은 평가되지 않았습니다. 또한 각막 신경분포의 완전성이 자가면역 전신 질환 환자의 눈물 기능을 결정하는 요인인지 여부도 불확실합니다.

   연구 그룹은 인간의 안구 표면에 대한 많은 임상 시험과 이미징 연구를 수행했습니다. 여기에는 Oculus(비침습적 눈물 분해 시간), 염색 등을 사용한 측정과 다중 비드 기반 샌드위치 면역형광 분석을 사용한 사이토카인 측정이 포함됩니다[32-38]

   예비 연구 연구 그룹은 또한 결막 면역 세포의 Eyeprim 수집과 현미경 검사(그림 2)와 결합된 상대적으로 새로운 유형의 유동 세포 계측법(그림 1)인 Amnis[31]를 사용하여 면역 마커 패널을 사용하여 분석 방법을 최적화했습니다. Amnis 기술의 장점은 분석된 세포를 직접 시각화하여 신호의 공동 위치 파악을 허용한다는 것입니다. 그들은 인간 그레이더와 비교하여 Amnis 소프트웨어를 사용한 세포 형태학적 파라미터 분석의 유효성에 대해 발표했습니다[31]. 또한 CD3, CD4, CD8, CCR7, CXCR3, CD109 및 CD63 염색을 정량화하기 위해 기존의 유세포 분석법(BD FACS)도 사용했습니다(데이터는 표시되지 않음).

   ENA 팀과 협력하여 그들의 팀은 CCM을 사용하여 각막 신경 및 수지상 세포의 정량화를 가능하게 하는 이미지 획득에 대한 교육을 받았습니다[1, 2, 4, 9, 10, 13, 14, 16, 21, 27](그림 3 ). ENA 팀에서 개발한 수동(CCMetrics) 및 자동(ACCMetrics) 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 기저 각막 신경 섬유 밀도, 각막 신경 가지 밀도, 각막 신경 섬유 길이 및 비틀림(그림 3, 4)을 정량화합니다. 기저부 성숙 및 미성숙 수지상 세포 밀도 및 각막 신경과 관련된 분포를 정량화할 것입니다.

   공동 작업자인 Malik 교수와 Dr. Petropoulos는 초기 신경병증 평가를 주도하고 있으며(ENA 팀-http://qatar-weill.cornell.edu/research/faculty/eng/index.html) 생체 내 CCM 사용을 개척했습니다. 당뇨병 및 기타 말초 신경병증을 모니터링하기 위한 신속하고 비침습적인 안과용 기기입니다. 그들은 최적의 이미지 캡처 교육 및 감독에 적극적으로 참여할 것이며 상세한 정량화 및 해석을 가능하게 하는 데 필요한 소프트웨어 및 라이선스 권한을 제공할 것입니다[9, 10, 12-14, 16, 17, 20, 21, 23-27].

2. 가설 및 목적 전체 장기 목표: 안구 표면 염증에 대한 안전하고 효과적인 치료법을 발견하고 류마티스 질환에서 면역 체계를 표적으로 하는 약물의 임상적 사용을 위한 안구 표면 적응증을 정의합니다.

   임상/의료 영향: 자가면역 질환에서 CCM을 사용하면 많은 이점이 있습니다. CCM을 사용하면 각막 신경과 수지상 세포를 빠르고 비침습적으로 영상화하여 자가면역 질환에서 염증 수준과 그 결과를 확인할 수 있습니다. 이를 통해 류마티스 클리닉에서 조기 진단, 위험 계층화 및 보다 시기 적절한 개입이 가능해 자가면역 환자의 다학제적 치료가 향상될 것입니다. 연구자는 더 많은 환자를 모집하기 위한 플랫폼으로 이 연구를 사용하여 표준 데이터베이스(독서 센터의 민족 또는 지역 연령별 데이터)를 구축할 것입니다.

   기본적인 과학적 의미: 각막 신경과 눈물 기능/면역학 사이의 관계에 대한 이해를 높입니다.

   단기 목표: 연구자들은 관련 전신 자가면역 또는 콜라겐 혈관 질환이 있거나 없는 안구 표면 염증 질환 환자의 임상 특징 및 결막 면역 세포를 연구하기 위해 Tan Tock Seng 병원과 협력하여 전국적인 연구를 제안합니다.

   학업 목표: 목표:

   • SERI와 STIIC(세포 분석)의 S Albani 간의 다학제간 협력 강화
   • 새로운 협업 구축(TTSH 안과의 Dr R Agrawal)
   • 현재 승인된 자금의 가치/시너지 증가: SERI 파일럿 보조금(파일럿 참가자 모집 및 도구 최적화),
   • 향후 자금 조달, NMRC STAR 상, CS 또는 CBIRG를 위해 경쟁하십시오.

   예상 결과:

   • 류마티스 질환의 다양한 전신 중증도, 안구 건조 증상, 눈물 기능, NIKBUT 및 각막 염색은 각막 신경 및 수지상/비수지상 세포 결함과 관련이 있을 수 있습니다.
   • 눈물 사이토카인은 각막 신경 및 수지상/비수지상 세포 결함과 관련이 있을 수 있습니다.
   • T 세포 또는 결막의 수지상 세포와 같은 다른 세포의 밀도 및 하위 유형의 변화(인상 세포학)는 각막 신경 및 수지상/비수지상 세포 결함과 관련될 수 있습니다.

   2.3 잠재적 위험 및 이점: 2.3.1 잠재적 위험

   • 인상 막을 사용하여 결막 세포를 샘플링하는 동안 약간의 불편함이 있을 수 있습니다.
   • 눈물 고임으로 인한 약간의 불편함 또는 발적(쉬르머 테스트)
   • 드물게 각막 상피 ​​결함이 in vivo 공초점 현미경에서 발생할 수 있지만 일반적으로 1-2일 내에 치유됩니다. 각막 상피 ​​결손은 각막이 찰과상을 입은 것처럼 한 층이 부서진 것을 의미합니다.
   • 국소 마취제(Alcaine)로 인한 따끔거림

   2.3.2 잠재적 이점 다양한 염증 매개체의 존재에 대한 이해가 높아짐에 따라 조사관은 자가면역 질환 환자에서 발생하는 복잡한 과정에 대한 더 깊은 통찰력을 얻을 수 있습니다.

3. 연구 모집단 3.1 등록할 피험자의 수와 특성을 나열합니다. 조사관은 3가지 특정 류마티스 진단 및 제어가 가능한 환자를 모집합니다.

   • SS(n=40), RA(n=40), SLE(n=40)
   • 건강한 연령/인종/성별 대조 대조군(n=40)

   총 샘플 크기: 160

4. 연구 설계 이것은 160명의 참가자를 포함하는 단면 연구입니다. 연구 기간: 1회 방문, 모집 기간: 1년

4.1.1 스크리닝 방문 및 절차 스크리닝 방문 및 절차는 별도의 날짜에 수행됩니다. TTSH에서 추천한 참가자는 안구 검사를 위해 SERI에 올 시간 슬롯이 할당됩니다. 절차 당일 SERI 코디네이터는 포함 및 제외 체크리스트를 기반으로 몇 가지 질문을 하여 적격 피험자를 선별합니다. 자격이 있는 것으로 확인되고 참가자가 관심이 있는 경우 SERI에서 동의를 얻고 SERI 검안사가 안구 평가를 진행합니다.

4.1.2 연구 절차

시험은 SERI 연구 팀 구성원이 수행합니다. 필수 검사 목록이 표시됩니다.

1. 안구 건조 증상(SPEED 설문지)
2. 비침습적 눈물 분해 시간(NIKBUT) - Oculus K5M
3. 결막 충혈 - Oculus K5M
4. Schirmers 스트립에서 눈물 수집
5. Impression Cytology - EyePrim 결막막 사용
6. 각막 플루오레세인 염색 - Oculus K5M
7. 생체 내 각막 공초점 현미경(CCM)
8. 참가자로부터 임상 정보 검색