Badanie sygnatur komórek odpornościowych w autoimmunizacji i zespole suchego oka

1. TŁO I UZASADNIENIE

   1.1 Ogólne wprowadzenie

   Choroby powierzchni oka, zwłaszcza zespół suchego oka i zapalenie twardówki, często dotykają pacjentów z chorobami autoimmunologicznymi. Komórki odpornościowe powierzchni oka są zwiększone w chorobie autoimmunologicznej; jednak pełny podzbiór aktywowanych komórek odpornościowych jest nieznany. Ostatnie badania eksperymentalne pokazują, że komórki dendrytyczne i limfocyty T w rogówce są krytycznie związane z unerwieniem nerwu rogówki. Rogówkowa mikroskopia konfokalna (CCM) umożliwia szybkie, nieinwazyjne obrazowanie in vivo komórek dendrytycznych i nerwów rogówki. Badacze proponują zbadanie, w jaki sposób zdrowie powierzchni oka, komórki układu odpornościowego spojówki i morfologia nerwu rogówki/komórek dendrytycznych oddziałują na siebie w 3 stanach reumatologicznych: zespole Sjögrena (SS), reumatoidalnym zapaleniu stawów (RZS), toczniu rumieniowatym układowym (SLE).

   Wstępne badania metodą cytometrii przepływowej pokazują, że różne komórki układu odpornościowego (np. komórki T, komórki B i komórki dendrytyczne) można określić ilościowo przy użyciu minimalnie inwazyjnych błon wyciskowych (Eyeprim). Klinicznie zespół badawczy ma doświadczenie w mierzeniu cech stanu zapalnego powierzchni oka (zaczerwienienie spojówek, czas rozpadu łez) za pomocą keratografu Oculus5M. Badacze zamierzają również zebrać komórki odpornościowe spojówki za pomocą cytologii impresyjnej i określić ilościowo określone typy komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Morfologia nerwu rogówki oraz gęstość i rozmieszczenie komórek dendrytycznych zostaną ocenione przy użyciu CCM; we współpracy z grupą, która była pionierem tej techniki.

   Badacze przewidują, że zmiany w parametrach nerwu rogówki i komórek dendrytycznych będą skorelowane z aktywacją/zapaleniem układu odpornościowego, pogorszeniem funkcji łez i zwiększoną ogólnoustrojową ciężkością choroby reumatologicznej. Ponadto badacz wysunął hipotezę, że im mniejsza gęstość nerwu rogówki, tym większa liczba komórek dendrytycznych rogówki i komórek zapalnych spojówki. Badanie tych zależności może pozwolić na lepsze mechanistyczne zrozumienie lokalnej i układowej aktywacji immunologicznej rogówki oraz opracowanie nieinwazyjnego okulistycznego zastępczego markera aktywacji komórek dendrytycznych i utraty włókien nerwowych, aby pomóc we wcześniejszej diagnozie, stratyfikacji ryzyka i opracowaniu nowych terapii w naszym pacjentów z chorobami autoimmunologicznymi z ciężkim zespołem suchego oka.

   1.2 Racjonalne dla celu badania

   Suche oko, rodzaj przewlekłego zapalenia powierzchni oka, jest bardzo rozpowszechnione i przyczynia się do ślepoty rogówkowej oraz stanowi poważne obciążenie dla zdrowia. Zapalenie twardówki jest chorobą zapalną powierzchni oka związaną z łagodnym do ciężkiego zapaleniem twardówki z zapaleniem wewnątrzgałkowym lub bez. Ciężki zespół suchego oka lub zapalenie twardówki jest związane z chorobami autoimmunologicznymi, takimi jak SS, RZS, SLE i inne stany. Obecne leczenie zespołu suchego oka często nie jest wystarczająco skuteczne (np. cyklosporyna) lub powoduje działania niepożądane (np. jaskra wywołana kortykosteroidami). W autoimmunologicznym zespole suchego oka dochodzi do uszkodzenia powierzchni oka i gruczołu łzowego o podłożu immunologicznym. W różnych modelach zespołu suchego oka wykazano, że składniki układu odpornościowego, takie jak limfocyty T, makrofagi i cytokiny, takie jak interleukina (IL) 1β i czynnik martwicy nowotworów (TNF)-α, mają kluczowe znaczenie dla wywołania i utrzymania tej choroby . Podobnie leczenie niezakaźnych twardówek jest sytuacją bardzo trudną dla wszystkich specjalistów zajmujących się zapaleniem błony naczyniowej oka.

   Komórki odpornościowe powierzchni oka są zwiększone, gdy występuje choroba autoimmunologiczna, proporcja lub liczba określonego typu komórek odpornościowych, np. monocytów lub limfocytów T CD4+ może być zwiększona w obecności cięższego miejscowego stanu zapalnego i/lub aktywności ogólnoustrojowej. Sygnatura nacieku komórek odpornościowych może być obecna w określonym stanie reumatologicznym. Jeśli pewne typy komórek (np. komórki T lub komórki B) dominują w chorobie ogólnoustrojowej, sugeruje to, że można zastosować podejście z komórkami T (np. takrolimus) lub podejście z komórkami B (np. rytuksymab). Alternatywnie, jeśli pewne cytokiny odgrywają główną rolę w suchym oku, można zastosować inhibitor sygnalizacji cytokin, taki jak inhibitor JAK.

   Ostatnie badania wykazały, że komórki dendrytyczne i limfocyty T w rogówce są krytycznie związane z unerwieniem nerwu rogówki [1, 2]. Wykazano to zarówno w badaniach na ludziach, jak i na zwierzętach [1-4]. Jednocześnie technologia obrazowania in vivo ludzkich nerwów rogówki i komórek dendrytycznych oraz ich kwantyfikacja uległy ostatnio znacznej poprawie. Doprowadziło to do eksplozji zainteresowania wykorzystaniem tej technologii jako zastępczego markera neuropatii obwodowych i zbadaniem leżących u jej podstaw mechanizmów [5-27]. Badacze wykazali wcześniej, że CCM pierwszej generacji może określić ilościowo obecność i gęstość komórek Langerhansa (LC) w warstwie Bowmana rogówki u pacjentów z cukrzycą [28]. Jednak najnowsza HRT III trzeciej generacji może być wykorzystana do klasyfikacji i oceny ilościowej komórek Langerhansa (LC) na fenotyp dojrzały (komórki dendrytyczne z długimi wypustkami) lub fenotyp niedojrzały (komórki niedendrytyczne pozbawione dendrytów komórkowych), aby zapewnić wgląd w zmiany immunologiczne w żywcem [29]. Niedawne badanie eksperymentalne na myszach z cukrzycą wykorzystało CCM, aby wykazać, że bezpośredni kontakt między DC a nerwami rogówki może wywołać uszkodzenie włókien nerwowych [30].

   Luka w wiedzy naukowej: Naukowcy wykazali, że poziom cytokin prozapalnych jest podwyższony we łzach ludzi z zespołem suchego oka; wiele z nich może być wydzielanych przez komórki odpornościowe. We wstępnych badaniach metodą cytometrii przepływowej stwierdzili, że limfocyty T CD4+, limfocyty B CD19+, monocyty CD14+, komórki dendrytyczne CD1c można określić ilościowo przy użyciu minimalnie inwazyjnych błon wyciskowych (Eyeprim)[31]. Nie jest znany pełny podzbiór komórek odpornościowych aktywowanych na powierzchni oka w zespole suchego oka oraz w różnych stanach reumatologicznych. Nie oceniano proporcji tych komórek w różnym nasileniu zespołu suchego oka i różnej aktywności ogólnoustrojowej choroby autoimmunologicznej. Ponadto nie jest pewne, czy integralność unerwienia rogówki jest również wyznacznikiem funkcji łez u pacjentów z autoimmunologiczną chorobą układową.

   Grupa badawcza przeprowadziła wiele badań klinicznych i badań obrazowych powierzchni ludzkiego oka. Obejmuje to pomiary za pomocą Oculus (nieinwazyjne czasy rozpadu łez), barwienie itp. oraz pomiar cytokin za pomocą testu immunofluorescencji typu „sandwich” opartego na multipleksowych kulkach [32-38]

   Badania wstępne Grupa badawcza zoptymalizowała również gromadzenie komórek odpornościowych spojówki przez Eyeprim oraz metodę analizy przy użyciu panelu markerów immunologicznych za pomocą Amnis [31], stosunkowo nowego typu cytometrii przepływowej (ryc. 1) połączonej z mikroskopią (ryc. 2). Zaletą techniki Amnis jest bezpośrednia wizualizacja analizowanych komórek w celu umożliwienia kolokalizacji sygnałów. Opublikowali na temat ważności analizy parametrów morfologicznych komórek za pomocą oprogramowania Amnis, w porównaniu z ludzkim narzędziem do oceniania [31]. Ponadto zastosowali również konwencjonalną cytometrię przepływową (BD FACS) do ilościowego określenia barwienia CD3, CD4, CD8, CCR7, CXCR3, CD109 i CD63 (dane nie pokazane).

   We współpracy z zespołem ENA, ich zespół został przeszkolony w akwizycji obrazu przy użyciu CCM, aby umożliwić ilościową ocenę nerwów rogówki i komórek dendrytycznych [1, 2, 4, 9, 10, 13, 14, 16, 21, 27] (ryc. 3) ). Gęstość włókien nerwu rogówkowego pod podstawą podstawy, gęstość gałęzi nerwu rogówki, długość i krętość włókien nerwowych rogówki (ryc. 3, 4) zostaną określone ilościowo przy użyciu zarówno ręcznego (CCMetrics), jak i automatycznego (ACCMetrics) oprogramowania do analizy obrazu, opracowanego przez zespół ENA. Określona zostanie ilościowo gęstość i rozmieszczenie dojrzałych i niedojrzałych komórek dendrytycznych w stosunku do nerwów rogówki.

   Współpracownicy, prof. Malik i dr Petropoulos, kierują oceną wczesnej neuropatii (zespół ENA-http://qatar-weill.cornell.edu/research/faculty/eng/index.html) i są pionierami w stosowaniu CCM in vivo jako szybkie, nieinwazyjne narzędzie okulistyczne do monitorowania neuropatii cukrzycowej i innych neuropatii obwodowych. Będą aktywnie angażować się w szkolenie i nadzorowanie optymalnego przechwytywania obrazu oraz zapewnią niezbędne oprogramowanie i uprawnienia licencyjne, aby umożliwić szczegółową kwantyfikację i interpretację [9, 10, 12-14, 16, 17, 20, 21, 23-27].

2. HIPOTEZA I CELE Ogólny cel długoterminowy: Odkrycie bezpiecznego i skutecznego leczenia zapalenia powierzchni oka oraz określenie wskazań powierzchni oka do klinicznego zastosowania leków działających na układ odpornościowy w chorobach reumatologicznych.

   Implikacje kliniczne / zdrowotne: Stosowanie CCM w chorobach autoimmunologicznych przynosi wiele korzyści. CCM pozwala na szybkie, nieinwazyjne obrazowanie nerwów rogówki i komórek dendrytycznych w celu określenia stopnia zapalenia i jego konsekwencji w chorobach autoimmunologicznych. Umożliwi to wcześniejszą diagnozę, stratyfikację ryzyka i bardziej terminową interwencję w klinikach reumatologicznych, usprawniając multidyscyplinarną opiekę nad pacjentami z chorobami autoimmunologicznymi. Badacz zbuduje normatywną bazę danych (dane etniczne lub lokalne dane dotyczące wieku z centrum czytelniczego), wykorzystując to badanie jako platformę do rekrutacji większej liczby pacjentów.

   Podstawowe implikacje naukowe: Postęp w zrozumieniu związku między nerwami rogówki a funkcją łez/immunologią.

   Cele krótkoterminowe: naukowcy proponują ogólnokrajowe badanie we współpracy ze szpitalem Tan Tock Seng Hospital w celu zbadania cech klinicznych i komórek odpornościowych spojówki u pacjentów z chorobą zapalną powierzchni oka z towarzyszącą ogólnoustrojową chorobą autoimmunologiczną lub kolagenową chorobą naczyniową lub bez niej.

   Cele akademickie: Dążyć do:

   • Wzmocnienie multidyscyplinarnej współpracy między SERI i S Albani z STIIC (analiza komórkowa)
   • Nawiąż nową współpracę (okulista TTSH, dr R. Agrawal)
   • Zwiększenie wartości/synergii z obecnie zatwierdzonego finansowania: grant pilotażowy SERI (rekrutacja uczestników pilotażu i optymalizacja narzędzi),
   • Rywalizuj o przyszłe fundusze, nagrodę NMRC STAR, CS lub CBIRG.

   Oczekiwane wyniki:

   • Różne nasilenie ogólnoustrojowe chorób reumatologicznych, objawy suchego oka, funkcji łzowej, NIKBUT i przebarwienia rogówki mogą korelować z defektami nerwu rogówki i komórek dendrytycznych/niedendrytycznych.
   • Cytokiny łzowe mogą korelować z defektami nerwu rogówki i komórek dendrytycznych/niedendrytycznych.
   • Zmiana gęstości i podtypów komórek T lub innych komórek, takich jak komórki dendrytyczne w spojówce (cytologia impresyjna), może korelować z defektami nerwu rogówki i komórek dendrytycznych/niedendrytycznych.

   2.3 Potencjalne ryzyko i korzyści: 2.3.1 Potencjalne ryzyko

   • Możliwe, że podczas pobierania próbek komórek spojówki za pomocą membrany wyciskowej może wystąpić lekki dyskomfort
   • Niewielki dyskomfort lub zaczerwienienie po zebraniu płynu łzowego (test Schirmera)
   • Rzadko może wystąpić ubytek nabłonka rogówki w mikroskopii konfokalnej in vivo, ale zazwyczaj goi się on w ciągu 1-2 dni. Ubytek nabłonka rogówki oznacza pęknięcie warstwy rogówki, podobnie jak w przypadku otarcia.
   • Uczucie pieczenia w wyniku znieczulenia miejscowego (Alcaine)

   2.3.2 Potencjalne korzyści Dzięki lepszemu zrozumieniu obecności różnych mediatorów stanu zapalnego badacze mogą uzyskać głębszy wgląd w złożony proces zachodzący u pacjentów z chorobami autoimmunologicznymi.

3. BADANA POPULACJA 3.1 Wypisz liczbę i charakter przedmiotów, które mają zostać zapisane. Badacze będą rekrutować pacjentów z 3 specyficznymi diagnozami reumatologicznymi i grupą kontrolną

   • SS (n=40), RZS (n=40), SLE (n=40)
   • Osoby kontrolne dopasowane pod względem wieku/pochodzenia etnicznego/płci (n=40)

   Całkowita wielkość próby: 160

4. PROJEKT BADANIA Jest to badanie przekrojowe z udziałem 160 uczestników. Czas trwania badania: jedna wizyta, czas trwania rekrutacji: 1 rok

4.1.1 Wizyta przesiewowa i procedury Wizyta przesiewowa i procedury zostaną przeprowadzone w osobnym dniu. Uczestnikom skierowanym z TTSH zostanie przydzielony przedział czasowy na przybycie do SERI na badania oczu. W dniu zabiegu koordynator SERI sprawdzi kwalifikujące się osoby, zadając im kilka pytań na podstawie listy kontrolnej włączenia i wyłączenia. Jeśli okaże się, że kwalifikuje się, a uczestnicy są zainteresowani, zgoda zostanie podjęta w SERI, a optometrysta SERI przystąpi do oceny wzroku.

4.1.2 Procedury badawcze

Egzaminy zostaną przeprowadzone przez członków zespołu badawczego SERI. Lista wymaganych badań jest przedstawiona:

1. Objawy suchego oka (kwestionariusz SPEED)
2. Nieinwazyjny czas przerywania łez (NIKBUT) — Oculus K5M
3. Zaczerwienienie spojówek – Oculus K5M
4. Pobieranie łez z paska Schirmersa
5. Cytologia wyciskowa - z użyciem błon spojówkowych EyePrim
6. Barwienie rogówki fluoresceiną – Oculus K5M
7. Mikroskopia konfokalna rogówki in vivo (CCM)
8. Pozyskiwanie informacji klinicznych od uczestników