Onderzoek naar immuuncelsignaturen bij auto-immuniteit en het droge ogen-syndroom

1. ACHTERGROND EN RATIONALE

   1.1 Algemene inleiding

   Oculaire oppervlakteziekte, vooral droge ogen en scleritis, treft vaak patiënten met auto-immuunziekten. Immuuncellen van het oogoppervlak zijn verhoogd bij auto-immuunziekten; de volledige subset van geactiveerde immuuncellen is echter onbekend. Recente experimentele studies tonen aan dat dendritische cellen en T-cellen in het hoornvlies kritisch geassocieerd zijn met de innervatie van de hoornvlieszenuw. Corneale confocale microscopie (CCM) maakt snelle niet-invasieve in vivo beeldvorming van dendritische cellen en hoornvlieszenuwen mogelijk. De onderzoekers stellen voor om te onderzoeken hoe de gezondheid van het oogoppervlak, conjunctivale immuuncellen en de morfologie van de hoornvlieszenuw/dendritische cel interageren bij 3 reumatologische aandoeningen: het syndroom van Sjögren (SS), reumatoïde artritis (RA), systemische lupus erythematosus (SLE).

   De voorlopige flowcytometrische studies laten zien dat verschillende immuuncellen (bijv.: T-cellen, B-cellen en dendritische cellen) kunnen worden gekwantificeerd met behulp van minimaal invasieve afdrukmembranen (Eyeprim). Klinisch heeft het onderzoeksteam ervaring met het meten van kenmerken van ontsteking van het oogoppervlak (conjunctivale roodheid, traanafbreektijden) met Oculus keratograph5M. De onderzoekers streven er ook naar conjunctivale immuuncellen te oogsten met behulp van afdrukcytologie en specifieke celtypen te kwantificeren met flowcytometrie. De morfologie van de hoornvlieszenuw en dendritische celdichtheid en -distributie zullen worden beoordeeld met behulp van CCM; in samenwerking met de groep die deze techniek heeft gepionierd.

   Onderzoekers verwachten dat veranderingen in de parameters van de hoornvlieszenuw en de dendritische cel zullen correleren met immuunactivering/ontsteking, verslechtering van de traanfunctie en toegenomen systemische ernst van de reumatologische ziekte. Bovendien veronderstelt de onderzoeker dat hoe lager de dichtheid van de hoornvlieszenuw, hoe hoger het aantal corneale dendritische cellen en conjunctivale ontstekingscellen. Het bestuderen van deze relaties kan een beter mechanistisch begrip van lokale corneale en systemische immuunactivatie mogelijk maken en de ontwikkeling van een niet-invasieve oftalmische surrogaatmarker van dendritische celactivering en verlies van zenuwvezels mogelijk maken om eerdere diagnose, risicostratificatie en de ontwikkeling van nieuwe therapieën in onze tijd mogelijk te maken. auto-immuunpatiënten met ernstige droge ogen.

   1.2 Rationeel voor het studiedoel

   Droge ogen, een vorm van chronische ontsteking van het oogoppervlak, komt veel voor en draagt ​​bij aan hoornvliesblindheid en vormt een ernstige belasting voor de gezondheid. Scleritis is een ontstekingsaandoening van het oogoppervlak die gepaard gaat met milde tot ernstige ontsteking van de sclera met of zonder intraoculaire ontsteking. Ernstige droge ogen of scleritis worden geassocieerd met auto-immuunziekten zoals SS, RA, SLE en andere aandoeningen. De huidige behandeling van droge ogen is vaak niet effectief genoeg (bijv. ciclosporine) of veroorzaakt bijwerkingen (bijv. door corticosteroïden geïnduceerd glaucoom). Bij auto-immuun droge ogen is er immuungemedieerde schade aan het oogoppervlak en de traanklier. In verschillende modellen van droge ogen is aangetoond dat componenten van het immuunsysteem zoals T-cellen, macrofagen en cytokines zoals interleukine (IL) 1β en tumornecrosefactor (TNF)-α van cruciaal belang zijn voor het uitlokken en in stand houden van deze ziekte. . Evenzo is de behandeling van niet-infectieuze scleritis een zeer uitdagende situatie voor alle uveïtisspecialisten.

   Oogoppervlak-immuuncellen zijn verhoogd wanneer auto-immuunziekte aanwezig is, ofwel het aandeel of het aantal van een bepaald type immuuncel, bijv. monocyten of CD4+ T-cellen kunnen verhoogd zijn in aanwezigheid van ernstigere lokale ontsteking en/of systemische activiteit. Een kenmerk van infiltratie van immuuncellen kan aanwezig zijn in een bepaalde reumatologische aandoening. Als bepaalde typen cellen (bijv. T-cellen of B-cellen) de overhand hebben in de systemische ziekte, suggereert dit dat een T-celbenadering (bijv. tacrolimus) of B-celbenadering (bijv. Rituxamab) kan worden gebruikt. Als alternatief, als bepaalde cytokines een belangrijke rol spelen bij droge ogen, kan een remmer van cytokinesignalering zoals een JAK-remmer worden gebruikt.

   Recente studies hebben aangetoond dat dendritische cellen en T-cellen in het hoornvlies kritisch geassocieerd zijn met de innervatie van de hoornvlieszenuw [1, 2]. Dit is aangetoond in zowel humane als dierstudies [1-4]. Tegelijkertijd is de technologie voor in vivo beeldvorming van menselijke hoornvlieszenuwen en dendritische cellen en hun kwantificering de laatste tijd sterk verbeterd. Dit heeft geleid tot een explosie van belangstelling voor het benutten van deze technologie als surrogaatmarker voor perifere neuropathieën en voor het onderzoeken van onderliggende mechanismen [5-27]. De onderzoekers hebben eerder aangetoond dat CCM van de eerste generatie de aanwezigheid en dichtheid van Langerhans-cellen (LC's) in Bowman's laag van het hoornvlies kan kwantificeren bij patiënten met diabetes [28]. De nieuwste 3e generatie HRT III kan echter worden gebruikt om Langerhans-cellen (LC's) te classificeren en te kwantificeren in een volwassen fenotype (dendritische cel met lange uitlopers) of een onrijp fenotype (niet-dendritische cel zonder celdendrieten) om inzicht te geven in immuunveranderingen in leven [29]. Een recent experimenteel onderzoek bij diabetische muizen heeft CCM gebruikt om aan te tonen dat direct contact tussen DC's en de hoornvlieszenuwen zenuwvezelbeschadiging kan veroorzaken [30].

   Gat in wetenschappelijke kennis: Onderzoekers hebben aangetoond dat pro-inflammatoire cytokines verhoogd zijn in tranen van mensen met droge ogen; veel van deze kunnen worden uitgescheiden door immuuncellen. Ze vonden in voorlopige flowcytometrische studies dat CD4+ T-cellen, CD19+ B-cellen, CD14+ monocyten, CD1c dendritische cellen kunnen worden gekwantificeerd met behulp van minimaal invasieve afdrukmembranen (Eyeprim)[31]. De volledige subset van geactiveerde immuuncellen in het oogoppervlak bij droge ogen en bij verschillende reumatologische aandoeningen is niet bekend. De verhoudingen van deze cellen in verschillende ernst van droge ogen en verschillende systemische activiteit van auto-immuunziekte zijn niet geëvalueerd. Bovendien is het onzeker of de integriteit van de innervatie van het hoornvlies ook een bepalende factor is voor de traanfunctie bij patiënten met een auto-immuunziekte.

   De onderzoeksgroep heeft vele klinische proeven en beeldvormingsstudies van het menselijke oogoppervlak uitgevoerd. Dit omvat metingen met Oculus (niet-invasieve traanopbreektijden), kleuring, enz., en de meting van cytokines met behulp van de op multiplex bead gebaseerde sandwich-immunofluorescentietest [32-38]

   Voorstudies De onderzoeksgroep heeft ook de Eyeprim-verzameling van conjunctivale immuuncellen en de analysemethode geoptimaliseerd met behulp van een panel van immuunmarkers met Amnis [31], een relatief nieuw type flowcytometrie (Figuur 1) in combinatie met microscopie (Figuur 2). Het voordeel van de Amnis-techniek is de directe visualisatie van geanalyseerde cellen om co-lokalisatie van signalen mogelijk te maken. Ze hebben gepubliceerd over de validiteit van de celmorfologische parameteranalyse met behulp van de Amnis-software, vergeleken met een menselijke grader [31]. Bovendien hebben ze ook conventionele flowcytometrie (BD FACS) gebruikt om CD3-, CD4-, CD8-, CCR7-, CXCR3-, CD109- en CD63-kleuring te kwantificeren (gegevens niet getoond).

   In samenwerking met het ENA-team is hun team getraind in beeldacquisitie met behulp van CCM om kwantificering van hoornvlieszenuwen en dendritische cellen mogelijk te maken [1, 2, 4, 9, 10, 13, 14, 16, 21, 27](Afbeelding 3 ). Sub-basale hoornvlieszenuwvezeldichtheid, hoornvlieszenuwtakdichtheid, hoornvlieszenuwvezellengte en kronkeligheid (Figuur 3, 4) zullen worden gekwantificeerd met behulp van zowel handmatige (CCMetrics) als geautomatiseerde (ACCMetrics) beeldanalysesoftware, ontwikkeld door het ENA-team. Sub-basale volgroeide en onrijpe dendritische celdichtheid en distributie in relatie tot hoornvlieszenuwen zullen worden gekwantificeerd.

   De medewerkers, prof. Malik en dr. Petropoulos leiden de evaluatie van vroege neuropathie (ENA-team-http://qatar-weill.cornell.edu/research/faculty/eng/index.html) en hebben pionierswerk verricht in het gebruik van in vivo CCM als een snel, niet-invasief oftalmisch instrument om diabetische en andere perifere neuropathieën te monitoren. Ze zullen actief deelnemen aan training en toezicht houden op optimale beeldopname en zullen de nodige software en licentierechten bieden om gedetailleerde kwantificering en interpretatie mogelijk te maken [9, 10, 12-14, 16, 17, 20, 21, 23-27].

2. HYPOTHESE EN DOELSTELLINGEN Algehele langetermijndoelstelling: Ontdek een veilige en effectieve behandeling van oogoppervlakontsteking en definieer de oogoppervlakindicaties voor klinisch gebruik van medicijnen gericht op het immuunsysteem bij reumatologische aandoeningen.

   Klinische / gezondheidszorgimplicaties: er zijn veel voordelen bij het gebruik van CCM bij auto-immuunziekten. CCM maakt snelle, niet-invasieve beeldvorming van de hoornvlieszenuwen en dendritische cellen mogelijk om het ontstekingsniveau en de gevolgen ervan bij auto-immuunziekten te bepalen. Dit maakt een eerdere diagnose, risicostratificatie en snellere interventie in de reumatologieklinieken mogelijk, waardoor de multidisciplinaire zorg voor auto-immuunpatiënten wordt verbeterd. De onderzoeker zal een normatieve database opbouwen (etnische of lokale leeftijdsspecifieke gegevens van een leescentrum) door deze studie te gebruiken als een platform om meer patiënten te werven.

   Fundamentele wetenschappelijke implicaties: beter begrip van de relatie tussen hoornvlieszenuwen en traanfunctie/immunologie.

   Kortetermijndoelstellingen: onderzoekers stellen een landelijke studie voor in samenwerking met het Tan Tock Seng-ziekenhuis om klinische kenmerken en conjunctivale immuuncellen te bestuderen bij patiënten met ontstekingsziekte van het oogoppervlak met of zonder geassocieerde systemische auto-immuun- of collageenvasculaire ziekte.

   Academische doelstellingen: Doel om:

   • Verbeter multidisciplinaire samenwerkingen, tussen SERI en S Albani van STIIC (celanalyse)
   • Bouw nieuwe samenwerkingen op (TTSH-oogarts dr. R. Agrawal)
   • Verhoog de waarde/synergie van momenteel goedgekeurde financiering: SERI-pilotsubsidie ​​(werving van pilot-deelnemers en optimalisatie van tools),
   • Strijd om toekomstige financiering, NMRC STAR-award, CS of CBIRG.

   Verwachte bevindingen:

   • Verschillende systemische ernst van de reumatologische aandoeningen, symptomen van droge ogen, traanfunctie, NIKBUT en verkleuring van het hoornvlies kunnen correleren met defecten van de hoornvlieszenuw en dendritische/niet-dendritische cellen.
   • Traancytokines kunnen correleren met hoornvlieszenuw en dendritische/niet-dendritische celdefecten.
   • Veranderingen in de dichtheid en subtypes van T-cellen of andere cellen zoals dendritische cellen in de conjunctiva (afdrukcytologie) kunnen correleren met hoornvlieszenuw- en dendritische/niet-dendritische celdefecten.

   2.3 Potentiële risico's en voordelen: 2.3.1 Potentiële risico's

   • Het is mogelijk dat er enig ongemak optreedt tijdens het afnemen van conjunctivale cellen met behulp van het afdrukmembraan
   • Enig licht ongemak of roodheid door ophoping van traanvocht (Schirmer-test)
   • Zelden kan een hoornvliesepitheeldefect optreden bij in vivo confocale microscopie, maar dit geneest over het algemeen binnen 1-2 dagen. Cornea-epitheeldefect betekent dat een laag van het hoornvlies is gebroken, vergelijkbaar met wat er gebeurde tijdens een schaafwond.
   • Stekend gevoel als gevolg van lokale verdoving (Alcaine)

   2.3.2 Potentiële voordelen Met een beter begrip van de aanwezigheid van verschillende ontstekingsmediatoren kunnen de onderzoekers meer inzicht krijgen in het complexe proces dat plaatsvindt bij patiënten met auto-immuunziekten.

3. ONDERZOEKSBEVOLKING 3.1 Maak een lijst van het aantal en de aard van de in te schrijven proefpersonen. De onderzoekers rekruteren patiënten met 3 specifieke reumatologische diagnoses en controles

   • SS (n=40), RA (n=40), SLE (n=40)
   • Gezonde leeftijd/etniciteit/geslacht gematchte controlepersonen (n=40)

   Totale steekproefomvang: 160

4. STUDIEOPZET Dit is een cross-sectioneel onderzoek met 160 deelnemers. Studieduur: één bezoek, wervingsduur: 1 jaar

4.1.1 Screeningsbezoek en procedures Screeningsbezoek en procedures vinden op een aparte dag plaats. Deelnemers die vanuit TTSH zijn doorverwezen, krijgen een tijdslot toegewezen om naar SERI te komen voor de oogonderzoeken. Op de dag van de procedure zal de SERI-coördinator screenen op in aanmerking komende proefpersonen door hen enkele vragen te stellen op basis van de in- en uitsluitingschecklist. Als blijkt dat ze in aanmerking komen en deelnemers geïnteresseerd zijn, zal toestemming worden gevraagd bij SERI en zal SERI optometrist doorgaan met de oculaire beoordelingen.

4.1.2 Studieprocedures

De examens worden afgenomen door leden van het SERI-studieteam. De lijst met vereiste examens wordt getoond:

1. Symptomen van droge ogen (SPEED-vragenlijst)
2. Niet-invasieve Tear Break-up Time (NIKBUT) - Oculus K5M
3. Conjunctivale roodheid - Oculus K5M
4. Scheurophoping van Schirmers strip
5. Impressie Cytologie - met behulp van EyePrim conjunctivale membranen
6. Hoornvliesfluoresceïnekleuring - Oculus K5M
7. In vivo corneale confocale microscopie (CCM)
8. Ophalen van klinische informatie van deelnemers