Zkoumání imunitních buněk při autoimunitě a syndromu suchého oka

1. POZADÍ A ODŮVODNĚNÍ

   1.1 Obecný úvod

   Onemocnění povrchu oka, zejména suché oko a skleritida, běžně postihují pacienty s autoimunitními chorobami. Imunitní buňky očního povrchu jsou zvýšené u autoimunitních onemocnění; avšak celá podskupina aktivovaných imunitních buněk není známa. Nedávné experimentální studie ukazují, že dendritické buňky a T buňky v rohovce jsou kriticky spojeny s inervací rohovkového nervu. Rohovková konfokální mikroskopie (CCM) umožňuje rychlé neinvazivní in vivo zobrazování dendritických buněk a rohovkových nervů. Vyšetřovatelé navrhují prozkoumat, jak se zdraví povrchu oka, imunitní buňky spojivky a morfologie rohovkových nervů/dendritických buněk vzájemně ovlivňují u 3 revmatologických stavů: Sjogrenův syndrom (SS), revmatoidní artritida (RA), systémový lupus erythematodes (SLE).

   Předběžné studie průtokové cytometrie ukazují, že různé imunitní buňky (např.: T buňky, B buňky a dendritické buňky) lze kvantifikovat pomocí minimálně invazivních otiskovacích membrán (Eyeprim). Klinicky má výzkumný tým zkušenosti s měřením projevů zánětu očního povrchu (zarudnutí spojivek, doba prasknutí slz) pomocí Oculus keratograph5M. Výzkumníci se také zaměřují na sběr spojivkových imunitních buněk pomocí otiskové cytologie a kvantifikaci specifických typů buněk pomocí průtokové cytometrie. Morfologie rohovkového nervu a hustota a distribuce dendritických buněk budou hodnoceny pomocí CCM; ve spolupráci se skupinou, která je průkopníkem této techniky.

   Výzkumníci předpokládají, že změny parametrů rohovkového nervu a dendritických buněk budou korelovat s imunitní aktivací/zánětem, zhoršením funkce slz a zvýšenou systémovou závažností revmatologického onemocnění. Kromě toho výzkumník předpokládá, že čím nižší je hustota rohovkového nervu, tím vyšší je počet dendritických buněk rohovky a zánětlivých buněk spojivky. Studium těchto vztahů může umožnit lepší mechanické pochopení lokální aktivace rohovky a systémové imunitní aktivace a vývoj neinvazivního očního náhradního markeru aktivace dendritických buněk a ztráty nervových vláken, což pomůže včasnější diagnóze, stratifikaci rizika a vývoji nových terapií v našem autoimunitní pacienti se závažným suchým okem.

   1.2 Racionální pro účely studie

   Suché oko, typ chronického zánětu očního povrchu, je velmi rozšířené a přispívá ke slepotě rohovky a představuje vážnou zdravotní zátěž. Skleritida je zánětlivá porucha očního povrchu spojená s mírným až závažným zánětem skléry s nitroočním zánětem nebo bez něj. Závažné suché oko nebo skleritida je spojena s autoimunitními onemocněními, jako je SS, RA, SLE a další stavy. Současná léčba suchého oka často není dostatečně účinná (např. cyklosporin) nebo způsobuje nežádoucí účinky (např. glaukom vyvolaný kortikosteroidy). U autoimunitního suchého oka dochází k imunitně zprostředkovanému poškození očního povrchu a slzné žlázy. Na různých modelech onemocnění suchého oka se ukázalo, že složky imunitního systému, jako jsou T buňky, makrofágy a cytokiny, jako je interleukin (IL) 1β a tumor nekrotizující faktor (TNF)-α, jsou kritické pro spuštění a udržení tohoto onemocnění. . Stejně tak léčba neinfekčních skleritů je velmi náročná situace pro všechny specialisty na uveitidu.

   Imunitní buňky očního povrchu jsou zvýšené, když je přítomno autoimunitní onemocnění, buď podíl nebo počet určitého typu imunitních buněk, např. monocyty nebo CD4+ T buňky mohou být zvýšeny v přítomnosti závažnějšího lokálního zánětu a/nebo systémové aktivity. Signatura infiltrace imunitních buněk může být přítomna v konkrétním revmatologickém stavu. Pokud určité typy buněk (např. T buňky nebo B buňky) převládají u systémového onemocnění, naznačuje to, že může být použit přístup T buněk (např. takrolimus) nebo přístup B buněk (např. rituxamab). Alternativně, pokud určité cytokiny hrají hlavní roli u suchého oka, může být použit inhibitor cytokinové signalizace, jako je inhibitor JAK.

   Nedávné studie ukázaly, že dendritické buňky a T buňky v rohovce jsou kriticky spojeny s inervací rohovkového nervu [1, 2]. To bylo prokázáno ve studiích na lidech i zvířatech [1-4]. Současně se v poslední době výrazně zlepšila technologie pro in vivo zobrazování lidských rohovkových nervů a dendritických buněk a jejich kvantifikace. To vedlo k explozi zájmu o využití této technologie jako náhradního markeru periferních neuropatií a prozkoumání základních mechanismů [5–27]. Výzkumníci již dříve prokázali, že první generace CCM může kvantifikovat přítomnost a hustotu Langerhansových buněk (LC) v Bowmanově vrstvě rohovky u pacientů s diabetem [28]. Nejnovější 3. generace HRT III však může být použita ke klasifikaci a kvantifikaci Langerhansových buněk (LC) na zralý fenotyp (dendritické buňky nesoucí dlouhé procesy) nebo nezralý fenotyp (nedendritické buňky postrádající buněčné dendrity), aby bylo možné nahlédnout do imunitních změn v vivo [29]. Nedávná experimentální studie na diabetických myších použila CCM k prokázání, že přímý kontakt mezi DC a rohovkovými nervy může vyvolat poškození nervových vláken [30].

   Mezera ve vědeckých poznatcích: Výzkumníci prokázali, že prozánětlivé cytokiny jsou zvýšené v slzách lidí se suchým okem; mnohé z nich mohou být vylučovány imunitními buňkami. V předběžných studiích průtokové cytometrie zjistili, že CD4+ T buňky, CD19+ B buňky, CD14+ monocyty, CD1c dendritické buňky lze kvantifikovat pomocí minimálně invazivních otiskovacích membrán (Eyeprim)[31]. Úplná podskupina imunitních buněk aktivovaných na povrchu oka u suchého oka a při různých revmatologických stavech není známa. Podíl těchto buněk v různé závažnosti suchého oka a různé systémové aktivitě autoimunitního onemocnění nebyl hodnocen. Dále není jisté, zda je integrita inervace rohovky také determinantou funkce slz u pacientů s autoimunitním systémovým onemocněním.

   Výzkumná skupina provedla mnoho klinických studií a zobrazovacích studií povrchu lidského oka. To zahrnuje měření pomocí Oculus (doby prasknutí neinvazivních slz), barvení atd. a měření cytokinů pomocí sendvičového imunofluorescenčního testu založeného na multiplexních kuličkách[32-38].

   Předběžné studie Výzkumná skupina také optimalizovala kolekci buněk imunity spojivek Eyeprim a metodu analýzy pomocí panelu imunitních markerů s Amnis [31], relativně novým typem průtokové cytometrie (obrázek 1) ve spojení s mikroskopií (obrázek 2). Výhodou techniky Amnis je přímá vizualizace analyzovaných buněk, která umožňuje společnou lokalizaci signálů. Publikovali o platnosti analýzy morfologických parametrů buněk pomocí softwaru Amnis ve srovnání s lidským srovnávačem [31]. Kromě toho také použili konvenční průtokovou cytometrii (BD FACS) ke kvantifikaci barvení CD3, CD4, CD8, CCR7, CXCR3, CD109 a CD63 (data nejsou uvedena).

   Ve spolupráci s týmem ENA byl jejich tým vyškolen v získávání snímků pomocí CCM, aby bylo možné kvantifikovat rohovkové nervy a dendritické buňky [1, 2, 4, 9, 10, 13, 14, 16, 21, 27] (obrázek 3 ). Sub-bazální hustota vláken rohovkového nervu, hustota větví rohovkového nervu, délka vláken rohovkového nervu a tortuozita (obrázek 3, 4) budou kvantifikovány pomocí manuálního (CCMetrics) i automatizovaného (ACCMetrics) softwaru pro analýzu obrazu vyvinutého týmem ENA. Bude kvantifikována subbazální hustota a distribuce zralých a nezralých dendritických buněk ve vztahu k rohovkovým nervům.

   Spolupracovníci, prof. Malik a Dr. Petropoulos, vedou hodnocení rané neuropatie (tým ENA-http://qatar-weill.cornell.edu/research/faculty/eng/index.html) a jsou průkopníky použití in vivo CCM jako rychlý, neinvazivní oční nástroj pro monitorování diabetických a jiných periferních neuropatií. Aktivně se zapojí do školení a dohlížejí na optimální snímání obrazu a poskytnou potřebný software a licenční práva, která umožní podrobnou kvantifikaci a interpretaci [9, 10, 12-14, 16, 17, 20, 21, 23-27].

2. HYPOTÉZA A CÍLE Celkový dlouhodobý cíl: Objevit bezpečnou a účinnou léčbu zánětu očního povrchu a definovat indikace očního povrchu pro klinické použití léků zaměřených na imunitní systém u revmatologických onemocnění.

   Klinické / zdravotní důsledky: Použití CCM u autoimunitních onemocnění má mnoho výhod. CCM umožňuje rychlé, neinvazivní zobrazení rohovkových nervů a dendritických buněk k určení úrovně zánětu a jeho následků u autoimunitních onemocnění. To umožní včasnější diagnostiku, stratifikaci rizika a včasnou intervenci na revmatologických ambulancích a posílí multidisciplinární péči o autoimunitní pacienty. Zkoušející vytvoří normativní databázi (buď etnická nebo místní věkově specifická data ze čtecího centra) pomocí této studie jako platformy pro nábor dalších pacientů.

   Základní vědecké implikace: Pokročilé porozumění vztahu mezi rohovkovými nervy a funkcí slz/imunologií.

   Krátkodobé cíle: výzkumníci navrhují celostátní studii ve spolupráci s nemocnicí Tan Tock Seng Hospital ke studiu klinických rysů a spojivkových imunitních buněk u pacientů se zánětlivým onemocněním očního povrchu s nebo bez souvisejícího systémového autoimunitního nebo kolagenového vaskulárního onemocnění.

   Akademické cíle: Cílem je:

   • Posílit multidisciplinární spolupráci mezi SERI a S Albani z STIIC (analýza buněk)
   • Vybudujte novou spolupráci (oční lékař TTSH Dr R Agrawal)
   • Zvýšení hodnoty/synergie z aktuálně schváleného financování: pilotní grant SERI (nábor účastníků pilotního projektu a optimalizace nástrojů),
   • Soutěžte o budoucí financování, ocenění NMRC STAR, CS nebo CBIRG.

   Očekávaná zjištění:

   • Různé systémové závažnosti revmatologických onemocnění, příznaky suchého oka, funkce slz, NIKBUT a barvení rohovky mohou korelovat s defekty rohovkového nervu a dendritických/nedendritických buněk.
   • Cytokiny slz mohou korelovat s defekty rohovkového nervu a dendritických/nedendritických buněk.
   • Změna v hustotě a podtypech T buněk nebo jiných buněk, jako jsou dendritické ve spojivce (impresní cytologie), může korelovat s defekty rohovkového nervu a dendritických/nedendritických buněk.

   2.3 Potenciální rizika a přínosy: 2.3.1 Potenciální rizika

   • Je možné, že při odběru vzorků spojivkových buněk pomocí impresní membrány může dojít k mírnému nepohodlí
   • Mírné nepohodlí nebo zarudnutí při odběru slzné tekutiny (Schirmerův test)
   • Vzácně se může objevit defekt rohovkového epitelu z in vivo konfokální mikroskopie, ale obvykle se hojí za 1-2 dny. Defekt rohovkového epitelu znamená, že vrstva rohovky je porušena, podobně jako to, co se stalo při abrazi.
   • Pocit štípání v důsledku lokálního anestetika (Alcaine)

   2.3.2 Potenciální přínosy S lepším pochopením přítomnosti různých zánětlivých mediátorů mohou výzkumníci získat další vhled do složitého procesu probíhajícího u pacientů s autoimunitními chorobami.

3. STUDIJNÍ POPULACE 3.1 Uveďte počet a povahu předmětů, které mají být zapsány. Vyšetřovatelé přijmou pacienty se 3 specifickými revmatologickými diagnózami a kontrolami

   • SS (n=40), RA (n=40), SLE (n=40)
   • Kontrolní subjekty zdravého věku/etnického původu/pohlaví (n=40)

   Celková velikost vzorku: 160

4. NÁVRH STUDIE Toto je průřezová studie zahrnující 160 účastníků. Délka studia: Jedna návštěva, doba náboru: 1 rok

4.1.1 Screeningová návštěva a procedury Screeningová návštěva a procedury budou provedeny v samostatný den. Účastníkům doporučeným z TTSH bude přidělen časový úsek, aby přišli do SERI na oční vyšetření. V den postupu koordinátor SERI prověří způsobilé subjekty tím, že jim položí několik otázek na základě kontrolního seznamu pro zařazení a vyloučení. Pokud bude shledán způsobilým a účastníci budou mít zájem, bude v SERI přijat souhlas a optometrista SERI bude pokračovat v očním hodnocení.

4.1.2 Studijní postupy

Zkoušky budou provádět členové studijního týmu SERI. Zobrazí se seznam požadovaných vyšetření:

1. Příznaky suchého oka (dotazník SPEED)
2. Neinvazivní doba roztržení (NIKBUT) – Oculus K5M
3. Zarudnutí spojivek - Oculus K5M
4. Kolekce slz od Schirmers strip
5. Impresní cytologie – pomocí spojivkových membrán EyePrim
6. Barvení rohovky fluoresceinem - Oculus K5M
7. In vivo rohovková konfokální mikroskopie (CCM)
8. Získávání klinických informací od účastníků