Udforskning af immuncellers signaturer i autoimmunitet og tørre øjne syndrom

1. BAGGRUND OG RATIONALE

   1.1 Generel introduktion

   Okulær overfladesygdom, især tørre øjne og skleritis, påvirker almindeligvis patienter med autoimmune sygdomme. Okulære overfladeimmunceller øges ved autoimmun sygdom; dog er den fulde undergruppe af aktiverede immunceller ukendt. Nylige eksperimentelle undersøgelser viser, at dendritiske celler og T-celler i hornhinden er kritisk forbundet med hornhindens nerveinnervation. Hornhindekonfokalmikroskopi (CCM) muliggør hurtig ikke-invasiv in vivo billeddannelse af dendritiske celler og hornhindenerver. Efterforskerne foreslår at undersøge, hvordan øjenoverfladesundhed, konjunktivale immunceller og corneal nerve/dendritisk cellemorfologi interagerer i 3 reumatologiske tilstande: Sjogrens syndrom (SS), Rheumatoid arthritis (RA), Systemisk lupus erythematosus (SLE).

   De foreløbige flowcytometriske undersøgelser viser, at forskellige immunceller (f.eks.: T-celler, B-celler og dendritiske celler) kan kvantificeres ved hjælp af minimalt invasive aftryksmembraner (Eyeprim). Klinisk har forskerholdet erfaring med at måle træk ved øjenoverfladebetændelse (konjunktival rødme, tårebrudstider) med Oculus keratograph5M. Efterforskerne sigter også mod at høste konjunktivale immunceller ved hjælp af aftrykscytologi og kvantificere specifikke celletyper med flowcytometri. Hornhindens nervemorfologi og dendritiske celletæthed og fordeling vil blive vurderet ved hjælp af CCM; i samarbejde med gruppen, der har været banebrydende for denne teknik.

   Forskere forudser, at ændringer i hornhindens nerve- og dendritiske celleparametre vil korrelere med immunaktivering/-inflammation, forringelse af tårefunktionen og øget systemisk sværhedsgrad af den reumatologiske sygdom. Derudover antager efterforskeren, at jo lavere hornhindens nervetæthed er, jo højere er antallet af hornhindedendritiske celler og konjunktivale inflammatoriske celler. At studere disse forhold kan muliggøre en bedre mekanistisk forståelse af lokal hornhinde- og systemisk immunaktivering og udviklingen af ​​en ikke-invasiv oftalmisk surrogatmarkør for dendritisk celleaktivering og tab af nervefibre for at hjælpe med tidligere diagnose, risikostratificering og udvikling af nye terapier i vores autoimmune patienter med alvorlige tørre øjne.

   1.2 Rational for undersøgelsesformålet

   Tørre øjne, en type kronisk øjenoverfladebetændelse, er meget udbredt og bidrager til hornhindeblindhed og påfører en alvorlig sundhedsbyrde. Scleritis er øjenoverfladebetændelse forbundet med mild til svær inflammation af sclera med eller uden intraokulær inflammation. Alvorlig tørre øjne eller scleritis er forbundet med autoimmune sygdomme som SS, RA, SLE og andre tilstande. Nuværende behandling af tørre øjne er ofte ikke effektiv nok (f.eks. cyclosporin) eller forårsager bivirkninger (f.eks. kortikosteroid-induceret glaukom). Ved autoimmune tørre øjne er der immunmedieret skade på øjets overflade og tårekirtlen. I forskellige modeller for tørre øjensygdomme er det blevet vist, at komponenter i immunsystemet såsom T-celler, makrofager og cytokiner såsom interleukin (IL) 1β og tumornekrosefaktor (TNF)-α er afgørende for at udløse og opretholde denne sygdom . Ligeledes er behandling af ikke-infektiøse sclerits en meget udfordrende situation for alle uveitis-specialister.

   Okulære overfladeimmunceller øges, når autoimmun sygdom er til stede, enten andelen eller antallet af en bestemt type immuncelle, f.eks. monocytter eller CD4+ T-celler kan øges i nærvær af mere alvorlig lokal inflammation og/eller systemisk aktivitet. En signatur på immuncelleinfiltration kan være til stede i en bestemt reumatologisk tilstand. Hvis visse typer af celler (f.eks. T-celler eller B-celler) er fremherskende i den systemiske sygdom, tyder det på, at en T-celletilgang (f.eks. tacrolimus) eller B-celletilgang (f.eks. rituxamab) kan anvendes. Alternativt, hvis visse cytokiner spiller en stor rolle ved tørre øjne, kan en hæmmer af cytokinsignalering, såsom en JAK-hæmmer, anvendes.

   Nylige undersøgelser har vist, at dendritiske celler og T-celler i hornhinden er kritisk forbundet med hornhindens nerveinnervation [1, 2]. Dette er blevet vist i både menneskelige og dyreforsøg [1-4]. Samtidig er teknologien til in vivo billeddannelse af menneskelige hornhindenerver og dendritiske celler og deres kvantificering forbedret betydeligt for nylig. Dette har ført til en eksplosion af interesse for at udnytte denne teknologi som en surrogatmarkør for perifere neuropatier og for at udforske underliggende mekanismer [5-27]. Forskerne har tidligere vist, at første generation af CCM kan kvantificere tilstedeværelsen og tætheden af ​​Langerhans-celler (LC'er) i Bowmans lag af hornhinden hos patienter med diabetes [28]. Den seneste 3. generations HRT III kan dog bruges til at klassificere og kvantificere Langerhanske celler (LC'er) til en moden fænotype (dendritisk celle, der bærer lange processer) eller en umoden fænotype (ikke-dendritisk celle, der mangler celledendritter) for at give indsigt i immunændringer i vivo [29]. Et nyligt eksperimentelt studie i diabetiske mus har brugt CCM til at vise, at direkte kontakt mellem DC'er og hornhindens nerver kan udløse nervefiberskade [30].

   Gab i videnskabelig viden: Forskere har vist, at proinflammatoriske cytokiner er forhøjet i tårer hos mennesker med tørre øjne; mange af disse kan udskilles af immunceller. De fandt i foreløbige flowcytometriske undersøgelser, at CD4+ T-celler, CD19+ B-celler, CD14+ monocytter, CD1c dendritiske celler kan kvantificeres ved hjælp af minimalt invasive aftryksmembraner (Eyeprim)[31]. Den fulde delmængde af immunceller aktiveret i øjets overflade i tørre øjne og ved forskellige reumatologiske tilstande kendes ikke. Andelene af disse celler i forskellig sværhedsgrad af tørre øjne og forskellig systemisk aktivitet af autoimmun sygdom er ikke blevet evalueret. Endvidere er det usikkert, om integriteten af ​​cornea-innervation også er en determinant for tårefunktionen hos patienter med autoimmun systemisk sygdom.

   Forskergruppen har foretaget mange kliniske forsøg og billeddiagnostiske undersøgelser af den menneskelige øjenoverflade. Dette inkluderer målinger med Oculus (ikke-invasive tårebrudstider), farvning osv., og måling af cytokiner ved hjælp af det multiplekse perlebaserede sandwich-immunfluorescensassay[32-38]

   Foreløbige undersøgelser Forskergruppen har også optimeret Eyeprim-indsamling af konjunktivale immunceller og analysemetode ved hjælp af et panel af immunmarkører med Amnis [31], en relativt ny type flowcytometri (figur 1) koblet med mikroskopi (figur 2). Fordelen ved Amnis-teknikken er den direkte visualisering af analyserede celler for at tillade co-lokalisering af signaler. De har publiceret om validiteten af ​​den cellemorfologiske parameteranalyse ved hjælp af Amnis-softwaren sammenlignet med en menneskelig grader [31]. Derudover har de også brugt konventionel flowcytometri (BD FACS) til at kvantificere CD3, CD4, CD8, CCR7, CXCR3, CD109 og CD63 farvning (data ikke vist).

   I samarbejde med ENA-teamet er deres team blevet trænet i billedopsamling ved hjælp af CCM for at muliggøre kvantificering af hornhindenerver og dendritiske celler [1, 2, 4, 9, 10, 13, 14, 16, 21, 27](Figur 3) ). Sub-basal corneal nervefibertæthed, corneal nervegrendensitet, corneal nervefiberlængde og snoethed (figur 3, 4) vil blive kvantificeret ved hjælp af både manuel (CCMetrics) og automatiseret (ACCMetrics) billedanalysesoftware, udviklet af ENA-teamet. Sub-basal modne og umodne dendritiske celletæthed og fordeling i forhold til corneale nerver vil blive kvantificeret.

   Samarbejdspartnerne, Prof Malik og Dr. Petropoulos leder vurderingen af ​​tidlig neuropati (ENA-team-http://qatar-weill.cornell.edu/research/faculty/eng/index.html) og har været banebrydende for brugen af ​​in vivo CCM som et hurtigt, ikke-invasivt oftalmisk instrument til at overvåge diabetiske og andre perifere neuropatier. De vil aktivt deltage i træning og overvåge optimal billedoptagelse og vil give de nødvendige software- og licensrettigheder for at muliggøre detaljeret kvantificering og fortolkning [9, 10, 12-14, 16, 17, 20, 21, 23-27].

2. HYPOTESE OG MÅL Overordnet langsigtet mål: Opdag sikker og effektiv behandling af øjenoverfladebetændelse og definere øjenoverfladeindikationer for klinisk brug af medicin rettet mod immunsystemet ved reumatologisk sygdom.

   Kliniske/sundhedsmæssige implikationer: Der er mange fordele ved at bruge CCM ved autoimmun sygdom. CCM tillader hurtig, ikke-invasiv billeddannelse af hornhindens nerver og dendritiske celler for at bestemme niveauet af inflammation og dens konsekvens i autoimmune sygdomme. Dette vil muliggøre tidligere diagnosticering, risikostratificering og mere rettidig intervention på de reumatologiske klinikker, hvilket forbedrer den tværfaglige behandling af autoimmune patienter. Forskeren vil bygge en normativ database (enten etniske eller lokale aldersspecifikke data fra et læsecenter) ved at bruge denne undersøgelse som en platform til at rekruttere flere patienter.

   Grundlæggende videnskabelige implikationer: Fremme forståelse af forholdet mellem hornhindenerver og tårefunktion/immunologi.

   Kortsigtede mål: Forskere foreslår en landsdækkende undersøgelse i samarbejde med Tan Tock Seng Hospital for at studere kliniske træk og konjunktivale immunceller hos patienter med inflammatorisk øjenoverfladesygdom med eller uden associeret systemisk autoimmun eller kollagen vaskulær sygdom.

   Faglige mål: Sigte mod at:

   • Forbedre tværfaglige samarbejder mellem SERI og S Albani fra STIIC (celleanalyse)
   • Byg nye samarbejder (TTSH øjenlæge Dr R Agrawal)
   • Øge værdi/synergi fra aktuelt godkendte midler: SERI pilotbevilling (rekruttering af pilotdeltagere og optimering af værktøjer),
   • Konkurrer om fremtidig finansiering, NMRC STAR-prisen, CS eller CBIRG.

   Forventede resultater:

   • Forskellige systemiske sværhedsgrader af de reumatologiske sygdomme, symptomer på tørre øjne, tårefunktion, NIKBUT og hornhindefarvning kan korrelere med hornhindenerve og dendritiske/ikke-dendritiske celledefekter.
   • Tårecytokiner kan korrelere med corneal nerve og dendritiske/ikke-dendritiske celledefekter.
   • Ændring i tætheden og undertyperne af T-celler eller andre celler såsom dendritiske i bindehinden (indtrykscytologi) kan korrelere med hornhindenerve og dendritiske/ikke-dendritiske celledefekter.

   2.3 Potentielle risici og fordele: 2.3.1 Potentielle risici

   • Det er muligt, at der kan være lidt ubehag under prøvetagning af konjunktivalceller ved hjælp af aftryksmembranen
   • Noget let ubehag eller rødme fra opsamling af tårevæske (Schirmer-test)
   • Sjældent kan der opstå en hornhindeepiteldefekt fra in vivo konfokal mikroskopi, men dette heler generelt på 1-2 dage. Hornhindeepiteldefekt betyder, at et lag af hornhinden er brudt, sammenlignet med hvad der skete under en slid.
   • Stikkende fornemmelse som følge af lokalbedøvelse (Alcaine)

   2.3.2 Potentielle fordele Med større forståelse for tilstedeværelsen af ​​forskellige inflammatoriske mediatorer kan efterforskerne få yderligere indsigt i den komplekse proces, der finder sted hos patienter med autoimmune sygdomme.

3. STUDIEBEFOLKNING 3.1 Liste over antallet og arten af ​​emner, der skal tilmeldes. Efterforskerne vil rekruttere patienter med 3 specifikke reumatologiske diagnoser og kontroller

   • SS (n=40), RA (n=40), SLE (n=40)
   • Sunde kontrolpersoner, der matcher alder/etnicitet/køn (n=40)

   Samlet prøvestørrelse: 160

4. STUDIEDESIGN Dette er et tværsnitsstudie med 160 deltagere. Studievarighed: Et besøg, rekrutteringsvarighed: 1 år

4.1.1 Screeningsbesøg og -procedurer Screeningsbesøg og -procedurer vil blive udført på en separat dag. Deltagere, der henvises fra TTSH, vil blive tildelt en tid til at komme til SERI for øjenundersøgelserne. På proceduredagen vil SERI-koordinator screene for berettigede emner ved at stille dem nogle spørgsmål baseret på tjeklisten for inklusion og udelukkelse. Hvis det viser sig at være berettiget, og deltagerne er interesserede, vil samtykke blive indhentet hos SERI, og SERI optometrist vil fortsætte med de okulære vurderinger.

4.1.2 Undersøgelsesprocedurer

Undersøgelserne vil blive udført af SERI-studieteamets medlemmer. Listen over obligatoriske prøver er vist:

1. Symptomer på tørre øjne (SPEED-spørgeskema)
2. Ikke-invasiv tårebrudstid (NIKBUT)- Oculus K5M
3. Konjunktival rødme- Oculus K5M
4. Tåresamling fra Schirmers strip
5. Impression Cytology-brug af EyePrim konjunktivale membraner
6. Hornhindefluoresceinfarvning- Oculus K5M
7. In vivo corneal konfokal mikroskopi (CCM)
8. Hentning af klinisk information fra deltagere