Erforschung von Immunzellsignaturen bei Autoimmunität und Syndrom des trockenen Auges

1. HINTERGRUND UND BEGRÜNDUNG

   1.1 Allgemeine Einführung

   Erkrankungen der Augenoberfläche, insbesondere Trockenes Auge und Skleritis, betreffen häufig Patienten mit Autoimmunerkrankungen. Immunzellen der Augenoberfläche sind bei Autoimmunerkrankungen erhöht; Die vollständige Untergruppe der aktivierten Immunzellen ist jedoch unbekannt. Jüngste experimentelle Studien zeigen, dass dendritische Zellen und T-Zellen in der Hornhaut entscheidend mit der Innervation von Hornhautnerven assoziiert sind. Die konfokale Hornhautmikroskopie (CCM) ermöglicht eine schnelle, nicht-invasive In-vivo-Bildgebung von dendritischen Zellen und Hornhautnerven. Die Forscher schlagen vor zu untersuchen, wie die Gesundheit der Augenoberfläche, konjunktivale Immunzellen und die Morphologie von Hornhautnerven/dendritischen Zellen bei 3 rheumatologischen Erkrankungen interagieren: Sjögren-Syndrom (SS), rheumatoide Arthritis (RA), systemischer Lupus erythematodes (SLE).

   Die vorläufigen durchflusszytometrischen Studien zeigen, dass verschiedene Immunzellen (z. B. T-Zellen, B-Zellen und dendritische Zellen) mit minimal-invasiven Abdruckmembranen (Eyeprim) quantifiziert werden können. Klinisch ist das Forschungsteam erfahren in der Messung von Merkmalen von Entzündungen der Augenoberfläche (Bindehautrötung, Tränenbruchzeiten) mit dem Oculus Keratograph5M. Die Forscher zielen auch darauf ab, konjunktivale Immunzellen mittels Impressionszytologie zu ernten und spezifische Zelltypen mit Durchflusszytometrie zu quantifizieren. Die Morphologie der Hornhautnerven sowie die Dichte und Verteilung dendritischer Zellen werden mit CCM bewertet; in Zusammenarbeit mit der Gruppe, die diese Technik entwickelt hat.

   Die Forscher gehen davon aus, dass Veränderungen der Parameter des Hornhautnervs und der dendritischen Zellen mit einer Immunaktivierung/-entzündung, einer Verschlechterung der Tränenfunktion und einem erhöhten systemischen Schweregrad der rheumatologischen Erkrankung korrelieren werden. Darüber hinaus stellt der Forscher die Hypothese auf, dass je geringer die Hornhautnervendichte ist, desto höher ist die Anzahl der dendritischen Hornhautzellen und Bindehautentzündungszellen. Die Untersuchung dieser Beziehungen kann ein besseres mechanistisches Verständnis der lokalen kornealen und systemischen Immunaktivierung und die Entwicklung eines nicht-invasiven ophthalmischen Surrogatmarkers für die Aktivierung dendritischer Zellen und den Verlust von Nervenfasern ermöglichen, um eine frühere Diagnose, Risikostratifizierung und die Entwicklung neuer Therapien in unserem zu unterstützen Autoimmunpatienten mit schwerem trockenem Auge.

   1.2 Begründung für den Studienzweck

   Trockenes Auge, eine Art chronischer Entzündung der Augenoberfläche, ist weit verbreitet und trägt zur Hornhautblindheit bei und verursacht eine schwere gesundheitliche Belastung. Skleritis ist eine entzündliche Erkrankung der Augenoberfläche, die mit einer leichten bis schweren Entzündung der Sklera mit oder ohne intraokularer Entzündung einhergeht. Schweres trockenes Auge oder Skleritis ist mit Autoimmunerkrankungen wie SS, RA, SLE und anderen Erkrankungen verbunden. Die derzeitige Behandlung des Trockenen Auges ist oft nicht wirksam genug (z. B. Cyclosporin) oder verursacht Nebenwirkungen (z. B. Kortikosteroid-induziertes Glaukom). Beim Autoimmun-Trockenen Auge kommt es zu einer immunvermittelten Schädigung der Augenoberfläche und der Tränendrüse. In verschiedenen Modellen des Trockenen Auges wurde gezeigt, dass Komponenten des Immunsystems wie T-Zellen, Makrophagen und Zytokine wie Interleukin (IL) 1β und Tumornekrosefaktor (TNF)-α entscheidend für die Auslösung und Aufrechterhaltung dieser Krankheit sind . Ebenso ist die Behandlung nicht-infektiöser Skleritis eine sehr herausfordernde Situation für alle Uveitis-Spezialisten.

   Immunzellen der Augenoberfläche sind erhöht, wenn eine Autoimmunerkrankung vorliegt, entweder der Anteil oder die Anzahl eines bestimmten Typs von Immunzellen, z. Monozyten oder CD4+ T-Zellen können bei schwerer lokaler Entzündung und/oder systemischer Aktivität erhöht sein. Eine Signatur einer Immunzellinfiltration kann bei einem bestimmten rheumatologischen Zustand vorhanden sein. Wenn bestimmte Zelltypen (z. B. T-Zellen oder B-Zellen) bei der systemischen Erkrankung vorherrschend sind, legt dies nahe, dass ein T-Zell-Ansatz (z. B. Tacrolimus) oder ein B-Zell-Ansatz (z. B. Rituxamab) verwendet werden kann. Wenn bestimmte Zytokine beim Trockenen Auge eine wichtige Rolle spielen, kann alternativ ein Inhibitor der Zytokin-Signalgebung wie ein JAK-Inhibitor verwendet werden.

   Jüngste Studien haben gezeigt, dass dendritische Zellen und T-Zellen in der Hornhaut entscheidend mit der Innervation der Hornhautnerven assoziiert sind [1, 2]. Dies wurde sowohl in Human- als auch in Tierstudien gezeigt [1-4]. Gleichzeitig hat sich die Technologie für die In-vivo-Bildgebung von menschlichen Hornhautnerven und dendritischen Zellen und deren Quantifizierung in letzter Zeit stark verbessert. Dies hat zu einem explosionsartigen Interesse an der Nutzung dieser Technologie als Ersatzmarker für periphere Neuropathien und zur Erforschung zugrunde liegender Mechanismen geführt [5-27]. Die Forscher haben zuvor gezeigt, dass CCM der ersten Generation das Vorhandensein und die Dichte von Langerhans-Zellen (LCs) in der Bowman-Schicht der Hornhaut bei Patienten mit Diabetes quantifizieren kann [28]. Der neueste HRT III der 3. Generation kann jedoch verwendet werden, um Langerhans-Zellen (LCs) in einen reifen Phänotyp (dendritische Zelle mit langen Fortsätzen) oder einen unreifen Phänotyp (nicht-dendritische Zelle ohne Zelldendriten) zu klassifizieren und zu quantifizieren, um einen Einblick in Immunveränderungen zu erhalten vivo [29]. Eine kürzlich durchgeführte experimentelle Studie an diabetischen Mäusen hat CCM verwendet, um zu zeigen, dass ein direkter Kontakt zwischen DCs und den Hornhautnerven eine Schädigung der Nervenfasern auslösen kann [30].

   Wissenslücke: Forscher haben gezeigt, dass entzündungsfördernde Zytokine in Tränen von Menschen mit trockenem Auge erhöht sind; Viele davon können von Immunzellen ausgeschieden werden. Sie fanden in vorläufigen durchflusszytometrischen Studien heraus, dass CD4+ T-Zellen, CD19+ B-Zellen, CD14+ Monozyten, dendritische CD1c-Zellen mit minimal-invasiven Abdruckmembranen (Eyeprim)[31] quantifiziert werden können. Die vollständige Untergruppe von Immunzellen, die in der Augenoberfläche beim Trockenen Auge und bei verschiedenen rheumatologischen Erkrankungen aktiviert werden, ist nicht bekannt. Die Anteile dieser Zellen bei unterschiedlichem Schweregrad des Trockenen Auges und unterschiedlicher systemischer Aktivität einer Autoimmunerkrankung wurden nicht bewertet. Darüber hinaus ist ungewiss, ob die Integrität der Hornhautinnervation auch eine Determinante der Tränenfunktion bei Patienten mit systemischer Autoimmunerkrankung ist.

   Die Forschungsgruppe hat viele klinische Studien und Bildgebungsstudien der menschlichen Augenoberfläche durchgeführt. Dazu gehören Messungen mit Oculus (nicht-invasive Tränenaufbruchszeiten), Färbungen usw. und die Messung von Zytokinen mit dem Multiplex-Kügelchen-basierten Sandwich-Immunfluoreszenz-Assay[32-38]

   Vorstudien Die Forschungsgruppe hat auch die Eyeprim-Sammlung von konjunktivalen Immunzellen und die Analysemethode unter Verwendung eines Panels von Immunmarkern mit Amnis [31], einer relativ neuen Art der Durchflusszytometrie (Abbildung 1) in Verbindung mit Mikroskopie (Abbildung 2), optimiert. Der Vorteil der Amnis-Technik ist die direkte Visualisierung der analysierten Zellen, um eine Kolokalisierung von Signalen zu ermöglichen. Sie haben die Gültigkeit der zellmorphologischen Parameteranalyse mit der Amnis-Software im Vergleich zu einem menschlichen Grader veröffentlicht [31]. Darüber hinaus haben sie auch konventionelle Durchflusszytometrie (BD FACS) verwendet, um die CD3-, CD4-, CD8-, CCR7-, CXCR3-, CD109- und CD63-Färbung zu quantifizieren (Daten nicht gezeigt).

   In Zusammenarbeit mit dem ENA-Team wurde ihr Team in der Bildaufnahme mit CCM geschult, um die Quantifizierung von Hornhautnerven und dendritischen Zellen zu ermöglichen [1, 2, 4, 9, 10, 13, 14, 16, 21, 27] (Abbildung 3 ). Die subbasale Dichte der Hornhautnervenfasern, die Dichte der Hornhautnervenäste, die Länge der Hornhautnervenfasern und die Tortuosität (Abbildung 3, 4) werden sowohl mit manueller (CCMetrics) als auch mit automatisierter (ACCMetrics) Bildanalysesoftware quantifiziert, die vom ENA-Team entwickelt wurde. Die Dichte und Verteilung der subbasalen reifen und unreifen dendritischen Zellen in Bezug auf die Hornhautnerven wird quantifiziert.

   Die Mitarbeiter Prof. Malik und Dr. Petropoulos leiten das Early Neuropathy Assessment (ENA Team-http://qatar-weill.cornell.edu/research/faculty/eng/index.html) und haben Pionierarbeit bei der Verwendung von in vivo CCM geleistet als schnelles, nicht-invasives ophthalmologisches Instrument zur Überwachung von diabetischen und anderen peripheren Neuropathien. Sie werden sich aktiv an der Schulung und Überwachung einer optimalen Bilderfassung beteiligen und die erforderliche Software und Lizenzrechte bereitstellen, um eine detaillierte Quantifizierung und Interpretation zu ermöglichen [9, 10, 12-14, 16, 17, 20, 21, 23-27].

2. HYPOTHESE UND ZIELE Langfristiges Gesamtziel: Entdeckung einer sicheren und wirksamen Behandlung von Entzündungen der Augenoberfläche und Definition der Indikationen der Augenoberfläche für die klinische Anwendung von Medikamenten, die auf das Immunsystem bei rheumatologischen Erkrankungen abzielen.

   Klinische / medizinische Implikationen: Es gibt viele Vorteile bei der Verwendung von CCM bei Autoimmunerkrankungen. CCM ermöglicht eine schnelle, nicht-invasive Bildgebung der Hornhautnerven und dendritischen Zellen, um das Ausmaß der Entzündung und ihre Folgen bei Autoimmunerkrankungen zu bestimmen. Dies wird eine frühere Diagnose, Risikostratifizierung und rechtzeitigere Intervention in den Rheumatologiekliniken ermöglichen und die multidisziplinäre Versorgung von Autoimmunpatienten verbessern. Der Forscher wird eine normative Datenbank (entweder ethnische oder lokale altersspezifische Daten aus einem Lesezentrum) aufbauen, indem er diese Studie als Plattform zur Rekrutierung weiterer Patienten verwendet.

   Grundlagenwissenschaftliche Implikationen: Erweitertes Verständnis der Beziehung zwischen Hornhautnerven und Tränenfunktion/Immunologie.

   Kurzfristige Ziele: Forscher schlagen eine landesweite Studie in Zusammenarbeit mit dem Tan Tock Seng Hospital vor, um klinische Merkmale und konjunktivale Immunzellen bei Patienten mit entzündlichen Erkrankungen der Augenoberfläche mit oder ohne assoziierter systemischer Autoimmun- oder Kollagenose zu untersuchen.

   Akademische Ziele: Ziele:

   • Verbesserung der multidisziplinären Zusammenarbeit zwischen SERI und S. Albani vom STIIC (Zellanalyse)
   • Bauen Sie neue Kooperationen auf (TTSH-Augenarzt Dr. R. Agrawal)
   • Wertsteigerung/Synergie aus aktuell bewilligten Fördermitteln: SBFI-Pilotstipendium (Rekrutierung von Pilotteilnehmenden und Optimierung von Tools),
   • Bewerben Sie sich um zukünftige Finanzierung, NMRC STAR Award, CS oder CBIRG.

   Erwartete Erkenntnisse:

   • Unterschiedliche systemische Schweregrade der rheumatologischen Erkrankungen, Symptome des Trockenen Auges, Tränenfunktion, NIKBUT und Hornhautverfärbung können mit Defekten des Hornhautnervs und dendritischer/nicht-dendritischer Zellen korrelieren.
   • Tränenzytokine können mit Hornhautnerven- und dendritischen/nicht-dendritischen Zelldefekten korrelieren.
   • Veränderungen in der Dichte und den Subtypen von T-Zellen oder anderen Zellen wie dendritischen in der Bindehaut (Impressionszytologie) können mit Defekten des Hornhautnervs und dendritischer/nicht-dendritischer Zellen korrelieren.

   2.3 Potentielle Risiken und Vorteile: 2.3.1 Potentielle Risiken

   • Es ist möglich, dass während der Entnahme von Bindehautzellen mit der Abdruckmembran ein leichtes Unbehagen auftritt
   • Einige leichte Beschwerden oder Rötungen durch Tränenflüssigkeitsansammlung (Schirmer-Test)
   • In seltenen Fällen kann bei der konfokalen In-vivo-Mikroskopie ein Hornhautepitheldefekt auftreten, der jedoch im Allgemeinen in 1-2 Tagen heilt. Ein Hornhautepitheldefekt bedeutet, dass eine Schicht der Hornhaut gebrochen ist, ähnlich wie bei einer Abschürfung.
   • Stechendes Gefühl als Folge der Lokalanästhesie (Alcain)

   2.3.2 Potentielle Vorteile Mit einem besseren Verständnis des Vorhandenseins verschiedener Entzündungsmediatoren können die Forscher weitere Einblicke in den komplexen Prozess gewinnen, der bei Patienten mit Autoimmunerkrankungen abläuft.

3. STUDIENPOPULATION 3.1 Liste der Anzahl und Art der einzuschreibenden Probanden. Die Ermittler rekrutieren Patienten mit 3 spezifischen rheumatologischen Diagnosen und Kontrollen

   • SS (n=40), RA (n=40), SLE (n=40)
   • Gesunde alters-/ethnische/geschlechtsspezifische Kontrollpersonen (n=40)

   Gesamtstichprobengröße: 160

4. STUDIENDESIGN Dies ist eine Querschnittsstudie mit 160 Teilnehmern. Studiendauer: Ein Besuch, Rekrutierungsdauer: 1 Jahr

4.1.1 Screening-Besuch und Verfahren Screening-Besuch und Verfahren werden an einem anderen Tag durchgeführt. Den vom TTSH überwiesenen Teilnehmenden wird ein Zeitfenster zugeteilt, um für die Augenuntersuchungen zum SBFI zu kommen. Am Tag des Verfahrens wird der SBFI-Koordinator anhand der Ein- und Ausschluss-Checkliste nach geeigneten Fächern suchen, indem er ihnen einige Fragen stellt. Wenn sich die Teilnahme als geeignet herausstellt und die Teilnehmer interessiert sind, wird die Zustimmung beim SERI eingeholt und der SERI-Optometrist wird mit den Augenbeurteilungen fortfahren.

4.1.2 Studienverfahren

Die Prüfungen werden von Mitgliedern des Studienteams des SBFI durchgeführt. Die Liste der erforderlichen Prüfungen wird angezeigt:

1. Symptome des trockenen Auges (SPEED-Fragebogen)
2. Nicht-invasive Tränenaufbruchzeit (NIKBUT) – Oculus K5M
3. Bindehautrötung – Oculus K5M
4. Tränensammlung vom Schirmers-Streifen
5. Impression Cytology- unter Verwendung von EyePrim Bindehautmembranen
6. Hornhaut-Fluorescein-Färbung – Oculus K5M
7. In-vivo-Hornhaut-Konfokalmikroskopie (CCM)
8. Abruf klinischer Informationen von Teilnehmern