Utforska immuncellers signaturer i autoimmunitet och torra ögon-syndrom

1. BAKGRUND OCH BAKGRUND

   1.1 Allmän introduktion

   Okulär ytasjukdom, särskilt torra ögon och sklerit, drabbar vanligtvis patienter med autoimmuna sjukdomar. Okulära ytimmunceller ökar vid autoimmun sjukdom; dock är hela undergruppen av aktiverade immunceller okänd. Nyligen genomförda experimentella studier visar att dendritiska celler och T-celler i hornhinnan är kritiskt associerade med innervation av hornhinnenerven. Korneal konfokalmikroskopi (CCM) möjliggör snabb icke-invasiv in vivo-avbildning av dendritiska celler och hornhinnenerver. Utredarna föreslår att undersöka hur ögonytans hälsa, konjunktivala immunceller och corneal nerv/dendritisk cellmorfologi interagerar vid 3 reumatologiska tillstånd: Sjögrens syndrom (SS), reumatoid artrit (RA), systemisk lupus erythematosus (SLE).

   De preliminära flödescytometriska studierna visar att olika immunceller (t.ex.: T-celler, B-celler och dendritiska celler) kan kvantifieras med hjälp av minimalt invasiva avtrycksmembran (Eyeprim). Kliniskt har forskargruppen erfarenhet av att mäta kännetecken för okulär ytinflammation (konjunktival rodnad, tårbrytningstider) med Oculus keratograph5M. Utredarna syftar också till att skörda konjunktivala immunceller med avtryckscytologi och kvantifiera specifika celltyper med flödescytometri. Corneal nervmorfologi och dendritiska celldensitet och distribution kommer att bedömas med hjälp av CCM; i samarbete med gruppen som har banat väg för denna teknik.

   Utredarna förutser att förändringar i parametrar för kornealnerven och dendritiska cellparametrarna kommer att korrelera med immunaktivering/inflammation, försämring av tårfunktionen och ökad systemisk svårighetsgrad av den reumatologiska sjukdomen. Dessutom antar utredaren att ju lägre hornhinnans nervtäthet är, desto högre är antalet dendritiska hornhinneceller och konjunktivala inflammatoriska celler. Att studera dessa samband kan möjliggöra en bättre mekanistisk förståelse av lokal hornhinne- och systemisk immunaktivering och utvecklingen av en icke-invasiv oftalmisk surrogatmarkör för aktivering av dendritiska celler och förlust av nervfibrer för att underlätta tidigare diagnos, riskstratifiering och utveckling av nya terapier i vår autoimmuna patienter med svår torra ögon.

   1.2 Rational för studieändamålet

   Torra ögon, en typ av kronisk okulär ytinflammation, är mycket utbredd och bidrar till hornhinneblindhet och medför en allvarlig hälsobörda. Sklerit är inflammatorisk okulär yta associerad med mild till svår inflammation i skleran med eller utan intraokulär inflammation. Allvarlig torra ögon eller sklerit är förknippad med autoimmuna sjukdomar som SS, RA, SLE och andra tillstånd. Nuvarande behandling av torra ögon är ofta inte tillräckligt effektiv (t.ex. ciklosporin) eller orsakar negativa effekter (t.ex. kortikosteroidinducerad glaukom). Vid autoimmuna torra ögon finns det immunförmedlad skada på ögonytan och tårkörteln. I olika modeller av torra ögonsjukdomar har det visat sig att komponenter i immunsystemet såsom T-celler, makrofager och cytokiner såsom interleukin (IL) 1β och tumörnekrosfaktor (TNF)-α är avgörande för att utlösa och bibehålla denna sjukdom . Likaså är behandling av icke-infektionssklerit en mycket utmanande situation för alla uveitspecialister.

   Okulära ytimmunceller ökar när autoimmun sjukdom är närvarande, antingen andelen eller antalet av en viss typ av immuncell, t.ex. monocyter eller CD4+ T-celler kan öka i närvaro av allvarligare lokal inflammation och/eller systemisk aktivitet. En signatur av immuncellsinfiltration kan vara närvarande vid ett särskilt reumatologiskt tillstånd. Om vissa typer av celler, (t.ex. T-celler eller B-celler) är dominerande i den systemiska sjukdomen, föreslår det att en T-cellsmetod (t.ex. takrolimus) eller B-cellsmetod (t.ex. rituxamab) kan användas. Alternativt, om vissa cytokiner spelar en viktig roll vid torra ögon, kan en hämmare av cytokinsignalering såsom en JAK-hämmare användas.

   Nyligen genomförda studier har visat att dendritiska celler och T-celler i hornhinnan är kritiskt associerade med innervation av hornhinnenerven [1, 2]. Detta har visats i både human- och djurstudier [1-4]. Samtidigt har tekniken för in vivo-avbildning av mänskliga hornhinnenerver och dendritiska celler och deras kvantifiering förbättrats avsevärt nyligen. Detta har lett till en explosion av intresse för att utnyttja denna teknologi som en surrogatmarkör för perifera neuropatier och för att utforska underliggande mekanismer [5-27]. Utredarna har tidigare visat att första generationens CCM kan kvantifiera närvaron och densiteten av Langerhans-celler (LCs) i Bowmans lager av hornhinnan hos patienter med diabetes [28]. Den senaste 3:e generationens HRT III kan dock användas för att klassificera och kvantifiera Langerhans-celler (LC) till en mogen fenotyp (dendritiska celler som bär långa processer) eller en omogen fenotyp (icke-dendritiska celler som saknar celldendriter) för att ge insikt i immunförändringar i vivo [29]. En nyligen genomförd experimentell studie på diabetiska möss har använt CCM för att visa att direktkontakt mellan DCs och hornhinnans nerver kan utlösa nervfiberskada [30].

   Klyfta i vetenskaplig kunskap: Forskare har visat att proinflammatoriska cytokiner är förhöjda i tårar hos människor med torra ögon; många av dessa kan utsöndras av immunceller. De fann i preliminära flödescytometriska studier att CD4+ T-celler, CD19+ B-celler, CD14+ monocyter, CD1c dendritiska celler kan kvantifieras med hjälp av minimalt invasiva avtrycksmembran (Eyeprim)[31]. Den fullständiga undergruppen av immunceller som aktiveras i ögonytan vid torra ögon och vid olika reumatologiska tillstånd är inte känd. Proportionerna av dessa celler i olika svårighetsgrad av torra ögon och olika systemisk aktivitet av autoimmun sjukdom har inte utvärderats. Vidare är det osäkert om integriteten av hornhinneinnervation också är en avgörande faktor för tårfunktionen hos patienter med autoimmun systemisk sjukdom.

   Forskargruppen har genomfört många kliniska prövningar och avbildningsstudier av den mänskliga ögonytan. Detta inkluderar mätningar med Oculus (icke-invasiva tårbrytningstider), färgning, etc., och mätning av cytokiner med hjälp av den multiplexpärlabaserade sandwich-immunfluorescensanalysen[32-38]

   Preliminära studier Forskargruppen har också optimerat Eyeprim-insamling av konjunktivala immunceller och analysmetod med hjälp av en panel av immunmarkörer med Amnis [31], en relativt ny typ av flödescytometri (Figur 1) i kombination med mikroskopi (Figur 2). Fördelen med Amnis-tekniken är den direkta visualiseringen av analyserade celler för att möjliggöra samlokalisering av signaler. De har publicerat om giltigheten av den cellmorfologiska parameteranalysen med hjälp av Amnis-mjukvaran, jämfört med en mänsklig graderare [31]. Dessutom har de också använt konventionell flödescytometri (BD FACS) för att kvantifiera CD3, CD4, CD8, CCR7, CXCR3, CD109 och CD63 färgning (data visas inte).

   I samarbete med ENA-teamet har deras team utbildats i bildinsamling med CCM för att möjliggöra kvantifiering av hornhinnenerver och dendritiska celler [1, 2, 4, 9, 10, 13, 14, 16, 21, 27](Figur 3) ). Sub-basal hornhinnens nervfibertäthet, hornhinnenervergrendensitet, hornhinnans nervfiberlängd och slingrande (Figur 3, 4) kommer att kvantifieras med både manuell (CCMetrics) och automatiserad (ACCMetrics) bildanalysmjukvara, utvecklad av ENA-teamet. Subbasal mogna och omogna dendritiska celldensitet och distribution i förhållande till hornhinnenerver kommer att kvantifieras.

   Samarbetspartnerna, Prof Malik och Dr. Petropoulos leder utvärderingen av tidig neuropati (ENA team-http://qatar-weill.cornell.edu/research/faculty/eng/index.html) och har banat väg för användningen av in vivo CCM som ett snabbt, icke-invasivt oftalmiskt instrument för att övervaka diabetiska och andra perifera neuropatier. De kommer aktivt att engagera sig i utbildning och övervaka optimal bildfångst och kommer att tillhandahålla nödvändig programvara och licensieringsprivilegier för att möjliggöra detaljerad kvantifiering och tolkning [9, 10, 12-14, 16, 17, 20, 21, 23-27].

2. HYPOTES OCH MÅL Övergripande långsiktiga mål: Upptäck säker och effektiv behandling för inflammation i ögonytan och definiera ögonytans indikationer för klinisk användning av läkemedel som riktar sig mot immunsystemet vid reumatologisk sjukdom.

   Kliniska/hälsovårdskonsekvenser: Det finns många fördelar med att använda CCM vid autoimmun sjukdom. CCM tillåter snabb, icke-invasiv avbildning av hornhinnenerverna och dendritiska cellerna för att bestämma nivån av inflammation och dess konsekvenser vid autoimmuna sjukdomar. Detta kommer att möjliggöra tidigare diagnos, riskstratifiering och snabbare ingripande vid reumatologiska kliniker, vilket förbättrar den multidisciplinära vården av autoimmuna patienter. Utredaren kommer att bygga en normativ databas (antingen etnisk eller lokal åldersspecifik data från ett läscenter) genom att använda denna studie som en plattform för att rekrytera fler patienter.

   Grundläggande vetenskapliga implikationer: Fördjupad förståelse av sambandet mellan hornhinnenerver och tårfunktion/immunologi.

   Kortsiktiga mål: forskare föreslår en rikstäckande studie i samarbete med Tan Tock Seng Hospital för att studera kliniska egenskaper och konjunktivala immunceller hos patienter med inflammatorisk sjukdom på ytan med eller utan associerad systemisk autoimmun eller kollagen kärlsjukdom.

   Akademiska mål: Syfta till att:

   • Förbättra multidisciplinära samarbeten, mellan SERI och S Albani från STIIC (cellanalys)
   • Bygg nya samarbeten (TTSH ögonläkare Dr R Agrawal)
   • Öka värde/synergi från för närvarande godkänd finansiering: SERI pilotbidrag (rekrytering av pilotdeltagare och optimering av verktyg),
   • Tävla om framtida finansiering, NMRC STAR-pris, CS eller CBIRG.

   Förväntade resultat:

   • Olika systemiska svårighetsgrader av de reumatologiska sjukdomarna, symtom på ögontorrhet, tårfunktion, NIKBUT och hornhinnefärgning kan korrelera med hornhinnenerv och dendritiska/icke-dendritiska celldefekter.
   • Tårcytokiner kan korrelera med defekter i hornhinnenerven och dendritiska/icke-dendritiska celldefekterna.
   • Förändring i densiteten och subtyperna av T-celler eller andra celler såsom dendritiska i bindhinnan (impressionscytologi) kan korrelera med hornhinnenerv och dendritiska/icke-dendritiska celldefekter.

   2.3 Potentiella risker och fördelar: 2.3.1 Potentiella risker

   • Det är möjligt att det kan förekomma något obehag vid provtagning av konjunktivala celler med avtrycksmembranet
   • Lite obehag eller rodnad från uppsamling av tårvätska (Schirmer-test)
   • I sällsynta fall kan en hornhinneepiteldefekt uppstå från in vivo konfokalmikroskopi, men detta läker vanligtvis inom 1-2 dagar. Korneala epiteldefekt innebär att ett lager av hornhinnan bryts, likt det som hände vid ett skrubbsår.
   • Stickande känsla som ett resultat av lokalbedövning (Alcaine)

   2.3.2 Potentiella fördelar Med större förståelse för förekomsten av olika inflammatoriska mediatorer kan utredarna få ytterligare insikt i den komplexa process som äger rum hos patienter med autoimmuna sjukdomar.

3. STUDIEPOPULATION 3.1 Lista antalet och arten av ämnen som ska registreras. Utredarna kommer att rekrytera patienter med 3 specifika reumatologiska diagnoser och kontroller

   • SS (n=40), RA (n=40), SLE (n=40)
   • Friska kontrollpersoner som matchar ålder/etnicitet/kön (n=40)

   Total provstorlek: 160

4. STUDIEDESIGN Detta är en tvärsnittsstudie med 160 deltagare. Studietid: Ett besök, rekryteringstid: 1 år

4.1.1 Screeningbesök och procedurer Screeningbesök och procedurer kommer att göras på en separat dag. Deltagare som remitteras från TTSH kommer att tilldelas en tid för att komma till SERI för ögonundersökningarna. På procedurdagen kommer SERI-samordnaren att undersöka berättigade ämnen genom att ställa några frågor till dem baserat på checklistan för inkludering och uteslutning. Om de visar sig vara berättigade och deltagarna är intresserade, kommer samtycke att tas av SERI och SERI-optikern kommer att fortsätta med ögonbedömningarna.

4.1.2 Studieprocedurer

Undersökningarna kommer att göras av SERI-studiegruppens medlemmar. Listan över obligatoriska undersökningar visas:

1. Symtom på torra ögon (SPEED Questionnaire)
2. Icke-invasiv tårbrytningstid (NIKBUT)- Oculus K5M
3. Konjunktival rodnad- Oculus K5M
4. Tårsamling från Schirmers strip
5. Impression Cytology - använder EyePrim konjunktiva membran
6. Hornhinnafluoresceinfärgning- Oculus K5M
7. In vivo korneal konfokalmikroskopi (CCM)
8. Hämtning av klinisk information från deltagare