Exploración de las firmas de células inmunitarias en la autoinmunidad y el síndrome del ojo seco

1. ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN

   1.1 Introducción general

   La enfermedad de la superficie ocular, especialmente el ojo seco y la escleritis, afecta comúnmente a pacientes con enfermedades autoinmunes. Las células inmunes de la superficie ocular aumentan en la enfermedad autoinmune; sin embargo, se desconoce el subconjunto completo de células inmunitarias activadas. Estudios experimentales recientes muestran que las células dendríticas y las células T en la córnea están asociadas críticamente con la inervación del nervio corneal. La microscopía confocal corneal (CCM) permite obtener imágenes in vivo rápidas y no invasivas de las células dendríticas y los nervios corneales. Los investigadores proponen investigar cómo interactúan la salud de la superficie ocular, las células inmunitarias conjuntivales y la morfología de las células dendríticas/nerviosas corneales en 3 afecciones reumatológicas: el síndrome de Sjogren (SS), la artritis reumatoide (AR) y el lupus eritematoso sistémico (LES).

   Los estudios preliminares de citometría de flujo muestran que varias células inmunitarias (p. ej., células T, células B y células dendríticas) se pueden cuantificar utilizando membranas de impresión mínimamente invasivas (Eyeprim). Clínicamente, el equipo de investigación tiene experiencia en la medición de las características de la inflamación de la superficie ocular (enrojecimiento de la conjuntiva, tiempos de ruptura de las lágrimas) con Oculus keratograph5M. Los investigadores también tienen como objetivo recolectar células inmunitarias conjuntivales mediante citología de impresión y cuantificar tipos de células específicos con citometría de flujo. La morfología del nervio corneal y la densidad y distribución de las células dendríticas se evaluarán mediante CCM; en colaboración con el grupo que ha sido pionero en esta técnica.

   Los investigadores anticipan que las alteraciones en los parámetros de las células dendríticas y del nervio corneal se correlacionarán con la activación/inflamación inmunitaria, el deterioro de la función lagrimal y el aumento de la gravedad sistémica de la enfermedad reumatológica. Además, el investigador plantea la hipótesis de que cuanto menor sea la densidad del nervio corneal, mayor será el número de células dendríticas corneales y células inflamatorias conjuntivales. El estudio de estas relaciones puede permitir una mejor comprensión mecánica de la activación inmunitaria sistémica y corneal local y el desarrollo de un marcador sustituto oftálmico no invasivo de la activación de las células dendríticas y la pérdida de fibras nerviosas para ayudar a un diagnóstico más temprano, la estratificación del riesgo y el desarrollo de nuevas terapias en nuestro pacientes autoinmunes con ojo seco severo.

   1.2 Racional para el Propósito del Estudio

   El ojo seco, un tipo de inflamación crónica de la superficie ocular, es muy frecuente y contribuye a la ceguera de la córnea e impone una grave carga de salud. La escleritis es un trastorno inflamatorio de la superficie ocular asociado con una inflamación leve a severa de la esclerótica con o sin inflamación intraocular. El ojo seco severo o la escleritis se asocian con enfermedades autoinmunes como SS, RA, SLE y otras afecciones. El tratamiento actual del ojo seco a menudo no es lo suficientemente efectivo (p. ej., ciclosporina) o causa efectos adversos (p. ej., glaucoma inducido por corticosteroides). En el ojo seco autoinmune, hay daño inmunomediado en la superficie ocular y la glándula lagrimal. En varios modelos de ojo seco, se ha demostrado que componentes del sistema inmunológico como las células T, macrófagos y citocinas como la interleucina (IL) 1β y el factor de necrosis tumoral (TNF)-α son fundamentales para desencadenar y mantener esta enfermedad. . Asimismo, el tratamiento de escleritos no infecciosos es una situación muy desafiante para todos los especialistas en uveítis.

   Las células inmunitarias de la superficie ocular aumentan cuando hay una enfermedad autoinmune, ya sea la proporción o el número de un tipo particular de célula inmunitaria, p. los monocitos o las células T CD4+ pueden aumentar en presencia de inflamación local y/o actividad sistémica más severa. Una firma de infiltración de células inmunes puede estar presente en una condición reumatológica particular. Si ciertos tipos de células (por ejemplo, células T o células B) son predominantes en la enfermedad sistémica, se sugiere que se puede usar un enfoque de células T (por ejemplo, tacrolimus) o de células B (por ejemplo, rituxamab). Alternativamente, si ciertas citoquinas juegan un papel importante en el ojo seco, se puede usar un inhibidor de la señalización de citoquinas, como un inhibidor de JAK.

   Estudios recientes han demostrado que las células dendríticas y las células T en la córnea están asociadas críticamente con la inervación del nervio corneal [1, 2]. Esto se ha demostrado en estudios con humanos y animales [1-4]. Al mismo tiempo, la tecnología para la obtención de imágenes in vivo de los nervios corneales humanos y las células dendríticas y su cuantificación han mejorado mucho recientemente. Esto ha llevado a una explosión de interés en el aprovechamiento de esta tecnología como marcador sustituto de las neuropatías periféricas y para explorar los mecanismos subyacentes [5-27]. Los investigadores han demostrado previamente que la CCM de primera generación puede cuantificar la presencia y densidad de células de Langerhans (LC) en la capa de Bowman de la córnea en pacientes con diabetes [28]. Sin embargo, el último HRT III de tercera generación se puede utilizar para clasificar y cuantificar las células de Langerhans (LC) en un fenotipo maduro (células dendríticas con procesos largos) o un fenotipo inmaduro (células no dendríticas que carecen de dendritas celulares) para proporcionar información sobre las alteraciones inmunitarias en vivos [29]. Un estudio experimental reciente en ratones diabéticos ha utilizado CCM para demostrar que el contacto directo entre las CD y los nervios corneales puede provocar daños en las fibras nerviosas [30].

   Brecha en el conocimiento científico: los investigadores han demostrado que las citoquinas proinflamatorias están elevadas en las lágrimas de humanos con ojo seco; muchos de estos pueden ser secretados por células inmunitarias. Descubrieron en estudios preliminares de citometría de flujo que las células T CD4+, las células B CD19+, los monocitos CD14+ y las células dendríticas CD1c se pueden cuantificar utilizando membranas de impresión mínimamente invasivas (Eyeprim)[31]. Se desconoce el subconjunto completo de células inmunitarias activadas en la superficie ocular en el ojo seco y en diversas afecciones reumatológicas. No se han evaluado las proporciones de estas células en diferente gravedad del ojo seco y diferente actividad sistémica de la enfermedad autoinmune. Además, no está claro si la integridad de la inervación de la córnea es también un factor determinante de la función lagrimal en pacientes con enfermedad sistémica autoinmune.

   El grupo de investigación ha llevado a cabo muchos ensayos clínicos y estudios de imágenes de la superficie ocular humana. Esto incluye mediciones con Oculus (tiempos de ruptura de lágrimas no invasivos), tinción, etc., y la medición de citocinas utilizando el ensayo de inmunofluorescencia en sándwich basado en microesferas multiplex[32-38]

   Estudios preliminares El grupo de investigación también optimizó la colección Eyeprim de células inmunes conjuntivales y el método de análisis utilizando un panel de marcadores inmunes con Amnis [31], un tipo relativamente nuevo de citometría de flujo (Figura 1) junto con microscopía (Figura 2). La ventaja de la técnica Amnis es la visualización directa de las células analizadas para permitir la colocalización de las señales. Han publicado sobre la validez del análisis de parámetros morfológicos celulares utilizando el software Amnis, en comparación con un clasificador humano [31]. Además, también han utilizado citometría de flujo convencional (BD FACS) para cuantificar la tinción de CD3, CD4, CD8, CCR7, CXCR3, CD109 y CD63 (datos no mostrados).

   En colaboración con el equipo de la ENA, su equipo ha sido capacitado en la adquisición de imágenes mediante CCM para permitir la cuantificación de los nervios corneales y las células dendríticas [1, 2, 4, 9, 10, 13, 14, 16, 21, 27] (Figura 3 ). La densidad de la fibra nerviosa corneal subbasal, la densidad de la rama nerviosa corneal, la longitud y la tortuosidad de la fibra nerviosa corneal (Figura 3, 4) se cuantificarán utilizando el software de análisis de imágenes manual (CCMetrics) y automatizado (ACCMetrics), desarrollado por el equipo de ENA. Se cuantificará la densidad y distribución de células dendríticas subbasales maduras e inmaduras en relación con los nervios corneales.

   Los colaboradores, el Prof. Malik y el Dr. Petropoulos, lideran la evaluación de la neuropatía temprana (equipo ENA-http://qatar-weill.cornell.edu/research/faculty/eng/index.html) y han sido pioneros en el uso de CCM in vivo como un instrumento oftálmico rápido y no invasivo para controlar la diabetes y otras neuropatías periféricas. Participarán activamente en la capacitación y supervisión de la captura óptima de imágenes y proporcionarán el software necesario y los privilegios de licencia para permitir una cuantificación e interpretación detalladas [9, 10, 12-14, 16, 17, 20, 21, 23-27].

2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS Objetivo general a largo plazo: Descubrir un tratamiento seguro y eficaz para la inflamación de la superficie ocular y definir las indicaciones de la superficie ocular para el uso clínico de medicamentos dirigidos al sistema inmunitario en enfermedades reumatológicas.

   Implicaciones clínicas/sanitarias: hay muchos beneficios en el uso de CCM en enfermedades autoinmunes. CCM permite obtener imágenes rápidas y no invasivas de los nervios corneales y las células dendríticas para determinar el nivel de inflamación y sus consecuencias en las enfermedades autoinmunes. Esto permitirá un diagnóstico más temprano, una estratificación de riesgo y una intervención más oportuna en las consultas de reumatología, potenciando la atención multidisciplinaria de los pacientes autoinmunes. El investigador construirá una base de datos normativa (ya sea información étnica o de edad local de un centro de lectura) mediante el uso de este estudio como plataforma para reclutar más pacientes.

   Implicaciones científicas básicas: comprensión avanzada de la relación entre los nervios corneales y la función/inmunología lagrimal.

   Objetivos a corto plazo: los investigadores proponen un estudio a nivel nacional en colaboración con el Hospital Tan Tock Seng para estudiar las características clínicas y las células inmunitarias conjuntivales en pacientes con enfermedad inflamatoria de la superficie ocular con o sin enfermedad vascular del colágeno o autoinmune sistémica asociada.

   Objetivos académicos: Aspirar a:

   • Potenciar las colaboraciones multidisciplinares, entre SERI y S Albani de STIIC (análisis celular)
   • Construir nuevas colaboraciones (oftalmólogo de TTSH Dr. R Agrawal)
   • Aumentar el valor/sinergia de la financiación actualmente aprobada: subvención piloto SERI (reclutamiento de participantes piloto y optimización de herramientas),
   • Compite por financiación futura, premio NMRC STAR, CS o CBIRG.

   Hallazgos esperados:

   • Las diferentes gravedades sistémicas de las enfermedades reumatológicas, los síntomas del ojo seco, la función lagrimal, el NIKBUT y la tinción de la córnea pueden correlacionarse con los defectos del nervio corneal y de las células dendríticas/no dendríticas.
   • Las citoquinas lagrimales pueden correlacionarse con los defectos del nervio corneal y de las células dendríticas/no dendríticas.
   • Los cambios en la densidad y los subtipos de las células T u otras células, como las dendríticas en la conjuntiva (citología de impresión), pueden correlacionarse con los defectos del nervio corneal y de las células dendríticas/no dendríticas.

   2.3 Riesgos y beneficios potenciales: 2.3.1 Riesgos potenciales

   • Es posible que haya alguna ligera molestia durante la toma de muestras de células conjuntivales utilizando la membrana de impresión.
   • Algunas molestias leves o enrojecimiento por la acumulación de líquido lagrimal (prueba de Schirmer)
   • En raras ocasiones, puede ocurrir un defecto epitelial corneal a partir de microscopía confocal in vivo, pero esto generalmente se cura en 1-2 días. Defecto del epitelio corneal significa que una capa de la córnea se rompe, de forma similar a lo que sucedió durante una abrasión.
   • Sensación de escozor como consecuencia de la anestesia local (Alcaine)

   2.3.2 Beneficios potenciales Con una mayor comprensión de la presencia de varios mediadores inflamatorios, los investigadores pueden obtener más información sobre el complejo proceso que tiene lugar en los pacientes con enfermedades autoinmunes.

3. POBLACIÓN DE ESTUDIO 3.1 Indique el Número y Naturaleza de las Materias a Matricular. Los investigadores reclutarán pacientes con 3 diagnósticos y controles reumatológicos específicos

   • SS (n=40), AR (n=40), LES (n=40)
   • Sujetos de control emparejados por edad/etnicidad/sexo sanos (n=40)

   Tamaño total de la muestra: 160

4. DISEÑO DEL ESTUDIO Este es un estudio transversal que involucró a 160 participantes. Duración del estudio: una visita, duración del reclutamiento: 1 año

4.1.1 Visita de evaluación y procedimientos La visita de evaluación y los procedimientos se realizarán en un día separado. A los participantes derivados de TTSH se les asignará un horario para venir a SERI para los exámenes oculares. El día del procedimiento, el coordinador de SERI evaluará a los sujetos elegibles haciéndoles algunas preguntas basadas en la lista de verificación de inclusión y exclusión. Si se determina que es elegible y los participantes están interesados, se tomará el consentimiento en SERI y el optometrista de SERI procederá con las evaluaciones oculares.

4.1.2 Procedimientos de estudio

Los exámenes serán realizados por miembros del equipo de estudio SERI. La lista de exámenes requeridos se muestra:

1. Síntomas de ojo seco (cuestionario SPEED)
2. Tiempo de rotura lagrimal no invasivo (NIKBUT) - Oculus K5M
3. Enrojecimiento Conjuntival- Oculus K5M
4. Colección de lágrimas de la tira de Schirmers
5. Citología de impresión: uso de membranas conjuntivales EyePrim
6. Tinción corneal con fluoresceína - Oculus K5M
7. Microscopía confocal corneal in vivo (CCM)
8. Recuperación de información clínica de los participantes