Utforsker immuncellesignaturer i autoimmunitet og tørre øyne syndrom

1. BAKGRUNN OG BEGRUNDELSE

   1.1 Generell introduksjon

   Okulær overflatesykdom, spesielt tørre øyne og skleritt, rammer ofte pasienter med autoimmune sykdommer. Okulære overflateimmunceller økes ved autoimmun sykdom; men hele undergruppen av immunceller som er aktivert er ukjent. Nyere eksperimentelle studier viser at dendritiske celler og T-celler i hornhinnen er kritisk assosiert med innervasjon av hornhinnenerven. Korneal konfokalmikroskopi (CCM) tillater rask ikke-invasiv in vivo avbildning av dendrittiske celler og hornhinnenerver. Etterforskerne foreslår å undersøke hvordan okulær overflatehelse, konjunktivale immunceller og hornhinnenerve/dendritisk cellemorfologi samhandler ved 3 revmatologiske tilstander: Sjogrens syndrom (SS), Revmatoid artritt (RA), Systemisk lupus erythematosus (SLE).

   De foreløpige flowcytometriske studiene viser at ulike immunceller (f.eks.: T-celler, B-celler og dendrittiske celler) kan kvantifiseres ved bruk av minimalt invasive avtrykksmembraner (Eyeprim). Klinisk har forskerteamet erfaring med å måle trekk ved okulær overflatebetennelse (konjunktival rødhet, tårebruddstider) med Oculus keratograph5M. Etterforskerne tar også sikte på å høste konjunktivale immunceller ved å bruke avtrykkscytologi og kvantifisere spesifikke celletyper med flowcytometri. Korneal nervemorfologi og dendritisk celletetthet og distribusjon vil bli vurdert ved bruk av CCM; i samarbeid med gruppen som har vært banebrytende for denne teknikken.

   Etterforskere forventer at endringer i hornhinnenerve og dendrittiske celleparametre vil korrelere med immunaktivering/betennelse, forverring av tårefunksjon og økt systemisk alvorlighetsgrad av den revmatologiske sykdommen. I tillegg antar etterforskeren at jo lavere nervetetthet i hornhinnen er, desto høyere er antall dendrittiske celler i hornhinnen og inflammatoriske konjunktivceller. Å studere disse sammenhengene kan muliggjøre en bedre mekanistisk forståelse av lokal hornhinne- og systemisk immunaktivering og utviklingen av en ikke-invasiv oftalmisk surrogatmarkør for dendrittiske celleaktivering og tap av nervefiber for å hjelpe tidligere diagnose, risikostratifisering og utvikling av nye terapier i vår autoimmune pasienter med alvorlig tørre øyne.

   1.2 Rasjonell for studieformålet

   Tørre øyne, en type kronisk øyeoverflatebetennelse, er svært utbredt og bidrar til hornhinneblindhet og påfører en alvorlig helsebelastning. Skleritt er betennelseslidelse i øyet forbundet med mild til alvorlig betennelse i sklera med eller uten intraokulær betennelse. Alvorlig tørre øyne eller skleritt er assosiert med autoimmune sykdommer som SS, RA, SLE og andre tilstander. Nåværende behandling av tørre øyne er ofte ikke effektiv nok (f.eks. ciklosporin) eller forårsaker bivirkninger (f.eks. kortikosteroidindusert glaukom). Ved autoimmune tørre øyne er det immunmediert skade på øyeoverflaten og tårekjertelen. I ulike modeller for tørre øyesykdommer er det vist at komponenter i immunsystemet som T-celler, makrofager og cytokiner som interleukin (IL) 1β og tumornekrosefaktor (TNF)-α er kritiske for å utløse og opprettholde denne sykdommen . Likeledes er behandling av ikke-infeksiøse skleritter en svært utfordrende situasjon for alle uveittspesialister.

   Okulære overflateimmunceller øker når autoimmun sykdom er tilstede, enten andelen eller antallet av en bestemt type immuncelle, f.eks. monocytter eller CD4+ T-celler kan øke i nærvær av mer alvorlig lokal betennelse og/eller systemisk aktivitet. En signatur på immuncelleinfiltrasjon kan være tilstede i en bestemt revmatologisk tilstand. Hvis visse typer celler, (f.eks. T-celler eller B-celler) er dominerende i den systemiske sykdommen, antyder det at en T-celletilnærming (f.eks. takrolimus) eller B-celletilnærming (f.eks. rituxamab) kan brukes. Alternativt, hvis visse cytokiner spiller en viktig rolle ved tørre øyne, kan en hemmer av cytokinsignalering som en JAK-hemmer brukes.

   Nyere studier har vist at dendrittiske celler og T-celler i hornhinnen er kritisk assosiert med innervasjon av hornhinnenerven [1, 2]. Dette er vist i både menneske- og dyrestudier [1-4]. Samtidig har teknologien for in vivo-avbildning av menneskelige hornhinnenerver og dendrittiske celler og deres kvantifisering blitt kraftig forbedret den siste tiden. Dette har ført til en eksplosjon av interesse for å utnytte denne teknologien som en surrogatmarkør for perifere nevropatier og for å utforske underliggende mekanismer [5-27]. Etterforskerne har tidligere vist at førstegenerasjons CCM kan kvantifisere tilstedeværelsen og tettheten av Langerhans-celler (LCs) i Bowmans lag av hornhinnen hos pasienter med diabetes [28]. Den siste 3. generasjons HRT III kan imidlertid brukes til å klassifisere og kvantifisere Langerhans-celler (LCs) til en moden fenotype (dendrittiske celler som bærer lange prosesser) eller en umoden fenotype (ikke-dendrittisk celle som mangler celledendritter) for å gi innsikt i immunforandringer i vivo [29]. En nylig eksperimentell studie på diabetiske mus har brukt CCM for å vise at direkte kontakt mellom DC-er og hornhinnenervene kan utløse nervefiberskade [30].

   Gap i vitenskapelig kunnskap: Forskere har vist at proinflammatoriske cytokiner er forhøyet i tårer hos mennesker med tørre øyne; mange av disse kan skilles ut av immunceller. De fant i foreløpige flowcytometriske studier at CD4+ T-celler, CD19+ B-celler, CD14+ monocytter, CD1c dendrittiske celler kan kvantifiseres ved bruk av minimalt invasive avtrykksmembraner (Eyeprim) [31]. Hele undergruppen av immunceller som aktiveres i øyeoverflaten ved tørre øyne og ved ulike revmatologiske tilstander, er ikke kjent. Andelene av disse cellene i ulik alvorlighetsgrad av tørre øyne og ulik systemisk aktivitet av autoimmun sykdom har ikke blitt evaluert. Videre er det usikkert om integriteten til hornhinneinnervering også er en bestemmende faktor for tårefunksjonen hos pasienter med autoimmun systemisk sykdom.

   Forskergruppen har gjennomført mange kliniske studier og avbildningsstudier av den menneskelige øyeoverflaten. Dette inkluderer målinger med Oculus (ikke-invasive tårebruddstider), farging, etc., og måling av cytokiner ved bruk av den multipleksperlebaserte sandwich-immunfluorescensanalysen[32-38]

   Foreløpige studier Forskergruppen har også optimert Eyeprim-innsamling av konjunktivale immunceller og analysemetode ved bruk av et panel av immunmarkører med Amnis [31], en relativt ny type flowcytometri (Figur 1) kombinert med mikroskopi (Figur 2). Fordelen med Amnis-teknikken er direkte visualisering av analyserte celler for å tillate samlokalisering av signaler. De har publisert om gyldigheten av den cellemorfologiske parameteranalysen ved bruk av Amnis-programvaren, sammenlignet med en menneskelig grader [31]. I tillegg har de også brukt konvensjonell flowcytometri (BD FACS) for å kvantifisere CD3, CD4, CD8, CCR7, CXCR3, CD109 og CD63 farging (data ikke vist).

   I samarbeid med ENA-teamet har teamet deres blitt opplært i bildeinnsamling ved bruk av CCM for å muliggjøre kvantifisering av hornhinnenerver og dendrittiske celler [1, 2, 4, 9, 10, 13, 14, 16, 21, 27] (Figur 3) ). Sub-basal hornhinnenervefibertetthet, hornhinnenervegrentetthet, hornhinnenervefiberlengde og kronglete (Figur 3, 4) vil kvantifiseres ved bruk av både manuell (CCMetrics) og automatisert (ACCMetrics) bildeanalyseprogramvare, utviklet av ENA-teamet. Sub-basal modne og umodne dendritisk celletetthet og fordeling i forhold til hornhinnenerver vil kvantifiseres.

   Samarbeidspartnerne, Prof Malik og Dr. Petropoulos leder vurderingen av tidlig nevropati (ENA team-http://qatar-weill.cornell.edu/research/faculty/eng/index.html) og har vært banebrytende for bruken av in vivo CCM som et raskt, ikke-invasivt oftalmisk instrument for å overvåke diabetiske og andre perifere nevropatier. De vil aktivt engasjere seg i opplæring og overvåking av optimal bildefangst og vil gi nødvendig programvare og lisensieringsprivilegier for å muliggjøre detaljert kvantifisering og tolkning [9, 10, 12-14, 16, 17, 20, 21, 23-27].

2. HYPOTESE OG MÅL Overordnet langsiktig mål: Oppdag sikker og effektiv behandling for øyeoverflatebetennelse og definere øyeoverflateindikasjoner for klinisk bruk av medisiner rettet mot immunsystemet ved revmatologisk sykdom.

   Kliniske implikasjoner/helsetjenester: Det er mange fordeler ved å bruke CCM ved autoimmun sykdom. CCM tillater rask, ikke-invasiv avbildning av hornhinnenerver og dendrittiske celler for å bestemme nivået av betennelse og dens konsekvens i autoimmune sykdommer. Dette vil muliggjøre tidligere diagnose, risikostratifisering og mer rettidig intervensjon ved revmatologiske klinikker, og forbedre den tverrfaglige behandlingen av autoimmune pasienter. Utforskeren vil bygge en normativ database (enten etniske eller lokale aldersspesifikke data fra et lesesenter) ved å bruke denne studien som en plattform for å rekruttere flere pasienter.

   Grunnleggende vitenskapelige implikasjoner: Forhåndsforståelse av forholdet mellom hornhinnenerver og tårefunksjon/immunologi.

   Kortsiktige mål: forskere foreslår en landsomfattende studie i samarbeid med Tan Tock Seng Hospital for å studere kliniske egenskaper og konjunktivale immunceller hos pasienter med inflammatorisk sykdom på øyeoverflaten med eller uten assosiert systemisk autoimmun eller kollagen vaskulær sykdom.

   Faglige mål: Mål å:

   • Forbedre tverrfaglige samarbeid, mellom SERI og S Albani fra STIIC (celleanalyse)
   • Bygg nye samarbeid (TTSH øyelege Dr R Agrawal)
   • Øke verdi/synergi fra nå godkjent finansiering: SERI pilotbevilgning (rekruttering av pilotdeltakere og optimalisering av verktøy),
   • Konkurrer om fremtidig finansiering, NMRC STAR-pris, CS eller CBIRG.

   Forventede funn:

   • Ulike systemiske alvorlighetsgrader av de revmatologiske sykdommene, symptomer på tørre øyne, tårefunksjon, NIKBUT og hornhinnefarging kan korrelere med hornhinnenerve og dendritiske/ikke-dendritiske celledefekter.
   • Tårecytokiner kan korrelere med hornhinnenerve og dendritiske/ikke-dendritiske celledefekter.
   • Endring i tetthet og undertyper av T-celler eller andre celler som dendritiske i konjunktiva (inntrykkscytologi) kan korrelere med hornhinnenerve og dendritiske/ikke-dendritiske celledefekter.

   2.3 Potensielle risikoer og fordeler: 2.3.1 Potensielle risikoer

   • Det er mulig at det kan være noe ubehag under prøvetaking av konjunktivalceller ved bruk av avtrykksmembranen
   • Noe lett ubehag eller rødhet fra oppsamling av tårevæske (Schirmer-test)
   • I sjeldne tilfeller kan en hornhinneepiteldefekt oppstå fra in vivo konfokal mikroskopi, men dette leges vanligvis i løpet av 1-2 dager. Kornealepiteldefekt betyr at et lag av hornhinnen er ødelagt, i likhet med det som skjedde under en skrubbsår.
   • Stikkende følelse som følge av lokalbedøvelse (Alcaine)

   2.3.2 Potensielle fordeler Med større forståelse for tilstedeværelsen av ulike inflammatoriske mediatorer, kan etterforskerne få ytterligere innsikt i den komplekse prosessen som foregår hos pasienter med autoimmune sykdommer.

3. STUDIEBEFOLKNING 3.1 Liste over antall og art av emner som skal meldes inn. Utforskerne skal rekruttere pasienter med 3 spesifikke revmatologiske diagnoser og kontroller

   • SS (n=40), RA (n=40), SLE (n=40)
   • Kontrollpersoner som samsvarer med sunne alder/etnisitet/kjønn (n=40)

   Total prøvestørrelse: 160

4. STUDIEDESIGN Dette er en tverrsnittsstudie med 160 deltakere. Studievarighet: Ett besøk, rekrutteringsvarighet: 1 år

4.1.1 Screeningbesøk og prosedyrer Screeningbesøk og prosedyrer vil bli gjort på en egen dag. Deltakere som henvises fra TTSH vil bli tildelt en tid for å komme til SERI for øyeundersøkelsene. På prosedyredagen vil SERI-koordinator screene for kvalifiserte emner ved å stille dem noen spørsmål basert på sjekklisten for inkludering og eksklusjon. Hvis det blir funnet å være kvalifisert og deltakerne er interessert, vil samtykke bli tatt av SERI og SERI optometrist vil fortsette med okulære vurderinger.

4.1.2 Studieprosedyrer

Eksamenene vil bli utført av SERI studieteammedlemmer. Listen over obligatoriske eksamener vises:

1. Symptomer på tørre øyne (SPEED-spørreskjema)
2. Ikke-invasiv rivebruddstid (NIKBUT)- Oculus K5M
3. Konjunktival rødhet- Oculus K5M
4. Tåresamling fra Schirmers stripe
5. Impression Cytology-bruker EyePrim konjunktivale membraner
6. Hornhinnefluoresceinfarging- Oculus K5M
7. In vivo korneal konfokal mikroskopi (CCM)
8. Innhenting av klinisk informasjon fra deltakere