Esplorare le firme delle cellule immunitarie nell'autoimmunità e nella sindrome dell'occhio secco

1. CONTESTO E RAZIONALE

   1.1 Introduzione generale

   Le malattie della superficie oculare, in particolare l'occhio secco e la sclerite, colpiscono comunemente i pazienti con malattie autoimmuni. Le cellule immunitarie della superficie oculare sono aumentate nelle malattie autoimmuni; tuttavia il sottoinsieme completo delle cellule immunitarie attivate è sconosciuto. Recenti studi sperimentali mostrano che le cellule dendritiche e le cellule T nella cornea sono associate in modo critico all'innervazione del nervo corneale. La microscopia confocale corneale (CCM) consente un rapido imaging in vivo non invasivo delle cellule dendritiche e dei nervi corneali. I ricercatori propongono di indagare su come la salute della superficie oculare, le cellule immunitarie congiuntivali e la morfologia delle cellule nervose/dendritiche corneali interagiscono in 3 condizioni reumatologiche: sindrome di Sjogren (SS), artrite reumatoide (RA), lupus eritematoso sistemico (LES).

   Gli studi citometrici a flusso preliminari mostrano che varie cellule immunitarie (ad esempio: cellule T, cellule B e cellule dendritiche) possono essere quantificate utilizzando membrane per impronte minimamente invasive (Eyeprim). Dal punto di vista clinico, il team di ricerca è esperto nella misurazione delle caratteristiche dell'infiammazione della superficie oculare (arrossamento congiuntivale, tempi di rottura lacrimale) con Oculus keratograph5M. Gli investigatori mirano anche a raccogliere cellule immunitarie congiuntivali utilizzando la citologia dell'impressione e quantificare specifici tipi di cellule con la citometria a flusso. La morfologia del nervo corneale e la densità e distribuzione delle cellule dendritiche saranno valutate mediante CCM; in collaborazione con il gruppo che ha aperto la strada a questa tecnica.

   Gli investigatori prevedono che le alterazioni dei parametri del nervo corneale e delle cellule dendritiche saranno correlate con l'attivazione/infiammazione immunitaria, il deterioramento della funzione lacrimale e l'aumento della gravità sistemica della malattia reumatologica. Inoltre, il ricercatore ipotizza che minore è la densità del nervo corneale, maggiore è il numero di cellule dendritiche corneali e di cellule infiammatorie congiuntivali. Lo studio di queste relazioni può consentire una migliore comprensione meccanicistica dell'attivazione immunitaria corneale e sistemica locale e lo sviluppo di un marcatore oftalmico surrogato non invasivo dell'attivazione delle cellule dendritiche e della perdita di fibre nervose per aiutare la diagnosi precoce, la stratificazione del rischio e lo sviluppo di nuove terapie nel nostro pazienti autoimmuni con secchezza oculare grave.

   1.2 Razionale per lo scopo dello studio

   L'occhio secco, un tipo di infiammazione cronica della superficie oculare, è molto diffuso e contribuisce alla cecità corneale e impone un grave onere per la salute. La sclerite è un disturbo infiammatorio della superficie oculare associato a infiammazione da lieve a grave della sclera con o senza infiammazione intraoculare. L'occhio secco o la sclerite grave è associato a malattie autoimmuni come SS, RA, SLE e altre condizioni. L'attuale trattamento dell'occhio secco spesso non è sufficientemente efficace (p. es., ciclosporina) o causa effetti avversi (p. es., glaucoma indotto da corticosteroidi). Nell'occhio secco autoimmune, vi è un danno immuno-mediato alla superficie oculare e alla ghiandola lacrimale. In vari modelli di malattia dell'occhio secco, è stato dimostrato che i componenti del sistema immunitario come le cellule T, i macrofagi e le citochine come l'interleuchina (IL) 1β e il fattore di necrosi tumorale (TNF)-α sono fondamentali per innescare e mantenere questa malattia . Allo stesso modo, il trattamento degli scleriti non infettivi è una situazione molto impegnativa per tutti gli specialisti dell'uveite.

   Le cellule immunitarie della superficie oculare sono aumentate quando è presente una malattia autoimmune, sia la proporzione che il numero di un particolare tipo di cellula immunitaria, ad es. i monociti o le cellule T CD4+ possono essere aumentati in presenza di infiammazione locale più grave e/o attività sistemica. Una firma dell'infiltrazione di cellule immunitarie può essere presente in una particolare condizione reumatologica. Se alcuni tipi di cellule (ad es. cellule T o cellule B) sono predominanti nella malattia sistemica, ciò suggerisce che può essere utilizzato un approccio con cellule T (ad es. tacrolimus) o B (ad es. Rituxamab). In alternativa, se alcune citochine svolgono un ruolo importante nell'occhio secco, può essere utilizzato un inibitore della segnalazione delle citochine come un inibitore JAK.

   Studi recenti hanno dimostrato che le cellule dendritiche e le cellule T nella cornea sono criticamente associate all'innervazione del nervo corneale [1, 2]. Ciò è stato dimostrato in studi sia sull'uomo che sugli animali [1-4]. Allo stesso tempo, la tecnologia per l'imaging in vivo dei nervi corneali umani e delle cellule dendritiche e la loro quantificazione sono notevolmente migliorate di recente. Ciò ha portato a un'esplosione di interesse nello sfruttare questa tecnologia come marker surrogato per le neuropatie periferiche e per esplorare i meccanismi sottostanti [5-27]. I ricercatori hanno precedentemente dimostrato che il CCM di prima generazione può quantificare la presenza e la densità delle cellule di Langerhans (LC) nello strato corneale di Bowman nei pazienti con diabete [28]. Tuttavia, l'ultima terza generazione di HRT III può essere utilizzata per classificare e quantificare le cellule di Langerhans (LC) in un fenotipo maturo (cellule dendritiche con processi lunghi) o in un fenotipo immaturo (cellule non dendritiche prive di dendriti cellulari) per fornire informazioni sulle alterazioni immunitarie in vivo [29]. Un recente studio sperimentale su topi diabetici ha utilizzato il CCM per dimostrare che il contatto diretto tra DC e nervi corneali può innescare danni alle fibre nervose [30].

   Lacuna nelle conoscenze scientifiche: i ricercatori hanno dimostrato che le citochine proinfiammatorie sono elevate nelle lacrime degli esseri umani con occhio secco; molti di questi possono essere secreti dalle cellule immunitarie. In studi preliminari di citometria a flusso hanno scoperto che le cellule T CD4+, le cellule B CD19+, i monociti CD14+, le cellule dendritiche CD1c possono essere quantificate utilizzando membrane per impronte minimamente invasive (Eyeprim)[31]. L'intero sottogruppo di cellule immunitarie attivate nella superficie oculare nell'occhio secco e in varie condizioni reumatologiche non è noto. Le proporzioni di queste cellule nella diversa gravità dell'occhio secco e nella diversa attività sistemica della malattia autoimmune non sono state valutate. Inoltre, non è chiaro se l'integrità dell'innervazione corneale sia anche un fattore determinante della funzione lacrimale nei pazienti con malattia sistemica autoimmune.

   Il gruppo di ricerca ha intrapreso numerosi studi clinici e studi di imaging della superficie oculare umana. Ciò include misurazioni con Oculus (tempi di rottura lacrimale non invasivi), colorazione, ecc. e la misurazione delle citochine utilizzando il saggio di immunofluorescenza a sandwich basato su microsfere multiplex[32-38]

   Studi preliminari Il gruppo di ricerca ha anche ottimizzato la raccolta Eyeprim di cellule immunitarie congiuntivali e il metodo di analisi utilizzando un pannello di marcatori immunitari con Amnis [31], un tipo relativamente nuovo di citometria a flusso (Figura 1) accoppiato con la microscopia (Figura 2). Il vantaggio della tecnica Amnis è la visualizzazione diretta delle cellule analizzate per consentire la co-localizzazione dei segnali. Hanno pubblicato sulla validità dell'analisi dei parametri morfologici cellulari utilizzando il software Amnis, rispetto a un selezionatore umano [31]. Inoltre, hanno anche utilizzato la citometria a flusso convenzionale (BD FACS) per quantificare la colorazione di CD3, CD4, CD8, CCR7, CXCR3, CD109 e CD63 (dati non mostrati).

   In collaborazione con il team ENA, il loro team è stato addestrato all'acquisizione di immagini utilizzando CCM per consentire la quantificazione dei nervi corneali e delle cellule dendritiche [1, 2, 4, 9, 10, 13, 14, 16, 21, 27] (Figura 3 ). La densità delle fibre nervose corneali sub-basali, la densità delle branche nervose corneali, la lunghezza e la tortuosità delle fibre nervose corneali (Figura 3, 4) saranno quantificate utilizzando il software di analisi delle immagini manuale (CCMetrics) e automatizzato (ACCMetrics), sviluppato dal team ENA. Verrà quantificata la densità e la distribuzione sub-basale delle cellule dendritiche mature e immature in relazione ai nervi corneali.

   I collaboratori, il Prof Malik e il Dr. Petropoulos stanno conducendo la valutazione della neuropatia precoce (ENA team-http://qatar-weill.cornell.edu/research/faculty/eng/index.html) e hanno aperto la strada all'uso del CCM in vivo come strumento oftalmico rapido e non invasivo per monitorare le neuropatie diabetiche e altre neuropatie periferiche. Si impegneranno attivamente nella formazione e nella supervisione dell'acquisizione ottimale delle immagini e forniranno il software necessario e i privilegi di licenza per consentire la quantificazione e l'interpretazione dettagliate [9, 10, 12-14, 16, 17, 20, 21, 23-27].

2. IPOTESI E OBIETTIVI Obiettivo generale a lungo termine: scoprire un trattamento sicuro ed efficace per l'infiammazione della superficie oculare e definire le indicazioni della superficie oculare per l'uso clinico di farmaci mirati al sistema immunitario nelle malattie reumatologiche.

   Implicazioni cliniche/sanitarie: ci sono molti vantaggi nell'uso del CCM nelle malattie autoimmuni. Il CCM consente un imaging rapido e non invasivo dei nervi corneali e delle cellule dendritiche per determinare il livello di infiammazione e le sue conseguenze nelle malattie autoimmuni. Ciò consentirà una diagnosi precoce, una stratificazione del rischio e un intervento più tempestivo presso le cliniche reumatologiche, migliorando la cura multidisciplinare dei pazienti autoimmuni. L'investigatore costruirà un database normativo (dati specifici per età etnica o locale da un centro di lettura) utilizzando questo studio come piattaforma per reclutare più pazienti.

   Implicazioni scientifiche di base: comprensione avanzata della relazione tra nervi corneali e funzione lacrimale/immunologia.

   Obiettivi a breve termine: i ricercatori propongono uno studio nazionale in collaborazione con l'ospedale Tan Tock Seng per studiare le caratteristiche cliniche e le cellule immunitarie congiuntivali in pazienti con malattia infiammatoria della superficie oculare con o senza malattia autoimmune sistemica associata o malattia vascolare del collagene.

   Obiettivi accademici: Mirare a:

   • Potenziare collaborazioni multidisciplinari, tra SERI e S Albani di STIIC (analisi cellulare)
   • Costruire nuove collaborazioni (oculista TTSH Dr R Agrawal)
   • Aumentare il valore/la sinergia dei finanziamenti attualmente approvati: sovvenzione pilota SERI (reclutamento di partecipanti pilota e ottimizzazione degli strumenti),
   • Competi per finanziamenti futuri, premio NMRC STAR, CS o CBIRG.

   Risultati attesi:

   • Diverse gravità sistemiche delle malattie reumatologiche, sintomi di secchezza oculare, funzione lacrimale, NIKBUT e colorazione corneale possono essere correlati a difetti del nervo corneale e delle cellule dendritiche/non dendritiche.
   • Le citochine lacrimali possono essere correlate con i difetti del nervo corneale e delle cellule dendritiche/non dendritiche.
   • Il cambiamento nella densità e nei sottotipi delle cellule T o di altre cellule come i dendritici nella congiuntiva (citologia da impronta) può essere correlato con i difetti del nervo corneale e delle cellule dendritiche/non dendritiche.

   2.3 Potenziali rischi e benefici: 2.3.1 Potenziali rischi

   • È possibile che durante il campionamento delle cellule congiuntivali utilizzando la membrana per impronte si verifichi un leggero disagio
   • Qualche leggero disagio o arrossamento dovuto alla raccolta di liquido lacrimale (test di Schirmer)
   • Raramente un difetto epiteliale corneale può verificarsi dalla microscopia confocale in vivo, ma questo generalmente guarisce in 1-2 giorni. Difetto epiteliale corneale significa che uno strato della cornea è rotto, paragonabile a quanto accaduto durante un'abrasione.
   • Sensazione di bruciore a seguito di anestesia locale (alcaina)

   2.3.2 Potenziali benefici Con una maggiore comprensione della presenza di vari mediatori dell'infiammazione, i ricercatori possono ottenere ulteriori informazioni sul complesso processo che si svolge nei pazienti con malattie autoimmuni.

3. POPOLAZIONE STUDIO 3.1 Elenco Il numero e la natura dei soggetti da iscrivere. Gli investigatori recluteranno pazienti con 3 diagnosi e controlli reumatologici specifici

   • SS (n=40), AR (n=40), LES (n=40)
   • Soggetti sani di controllo corrispondenti per età/etnia/sesso (n=40)

   Dimensione totale del campione: 160

4. DISEGNO DELLO STUDIO Si tratta di uno studio trasversale che coinvolge 160 partecipanti. Durata dello studio: una visita, durata del reclutamento: 1 anno

4.1.1 Visita di screening e procedure La visita di screening e le procedure verranno eseguite in un giorno separato. Ai partecipanti inviati dal TTSH verrà assegnata una fascia oraria per venire alla SEFRI per gli esami oculari. Il giorno della procedura, il coordinatore SEFRI esaminerà i soggetti idonei ponendo loro alcune domande sulla base della checklist di inclusione ed esclusione. Se ritenuto idoneo e i partecipanti sono interessati, il consenso verrà preso presso la SERI e l'optometrista della SERI procederà con le valutazioni oculari.

4.1.2 Procedure dello studio

Gli esami saranno svolti dai membri del gruppo di studio della SEFRI. Viene visualizzato l'elenco degli esami richiesti:

1. Sintomi dell'occhio secco (questionario SPEED)
2. Tempo di rottura lacrimale non invasivo (NIKBUT) - Oculus K5M
3. Rossore congiuntivale - Oculus K5M
4. Raccolta di lacrime dalla striscia di Schirmers
5. Impression Cytology- usando le membrane congiuntivali EyePrim
6. Colorazione corneale con fluoresceina - Oculus K5M
7. Microscopia confocale corneale in vivo (CCM)
8. Recupero di informazioni cliniche dai partecipanti