Immuunisolujen allekirjoitusten tutkiminen autoimmuniteetissa ja kuivasilmäisyyden oireyhtymässä

1. TAUSTA JA PERUSTELUT

   1.1 Yleinen johdanto

   Silmän pintasairaudet, erityisesti kuivasilmäisyys ja skleriitti, vaikuttavat yleisesti potilaisiin, joilla on autoimmuunisairauksia. Silmän pinnan immuunisolut lisääntyvät autoimmuunisairaudessa; aktivoituneiden immuunisolujen koko alajoukkoa ei kuitenkaan tunneta. Viimeaikaiset kokeelliset tutkimukset osoittavat, että sarveiskalvon dendriittisolut ja T-solut liittyvät kriittisesti sarveiskalvon hermotukseen. Sarveiskalvon konfokaalinen mikroskopia (CCM) mahdollistaa dendriittisolujen ja sarveiskalvon hermojen nopean ei-invasiivisen in vivo -kuvauksen. Tutkijat ehdottavat, että tutkitaan, kuinka silmän pinnan terveys, sidekalvon immuunisolut ja sarveiskalvon hermo-/dendriittisolumorfologia ovat vuorovaikutuksessa kolmessa reumatologisessa tilassa: Sjogrenin oireyhtymä (SS), nivelreuma (RA), systeeminen lupus erythematosus (SLE).

   Alustavat virtaussytometriset tutkimukset osoittavat, että eri immuunisolut (esim. T-solut, B-solut ja dendriittisolut) voidaan määrittää käyttämällä minimaalisesti invasiivisia impressiokalvoja (Eyeprim). Kliinisesti tutkimusryhmällä on kokemusta silmän pinnan tulehduksen piirteiden mittaamisesta (sidekalvon punoitus, kyynelten katkeamisajat) Oculus keratograph5M:llä. Tutkijat pyrkivät myös keräämään sidekalvon immuunisoluja käyttämällä impressiosytologiaa ja kvantifioimaan tiettyjä solutyyppejä virtaussytometrialla. Sarveiskalvon hermomorfologia ja dendriittisolujen tiheys ja jakautuminen arvioidaan käyttämällä CCM:ää; yhteistyössä tämän tekniikan edelläkävijän ryhmän kanssa.

   Tutkijat odottavat, että muutokset sarveiskalvon hermo- ja dendriittisoluparametreissa korreloivat immuuniaktivaation/tulehduksen, kyynelten toiminnan heikkenemisen ja reumatologisen sairauden lisääntyneen systeemisen vakavuuden kanssa. Lisäksi tutkija olettaa, että mitä pienempi sarveiskalvon hermotiheys on, sitä enemmän on sarveiskalvon dendriittisoluja ja sidekalvon tulehdussoluja. Näiden suhteiden tutkiminen voi mahdollistaa paremman mekaanisen ymmärryksen paikallisesta sarveiskalvon ja systeemisestä immuuniaktivaatiosta ja dendriittisolujen aktivoitumisen ja hermosäikeiden katoamisen ei-invasiivisen oftalmisen korvikemarkkerin kehittämisen auttamaan aikaisempaa diagnoosia, riskien kerrostumista ja uusien hoitomuotojen kehittämistä. autoimmuunipotilaat, joilla on vaikea kuivasilmäisyys.

   1.2 Tutkimustarkoituksen kannalta järkevä

   Kuivasilmäisyys, eräänlainen krooninen silmän pinnan tulehdus, on erittäin yleinen ja aiheuttaa sarveiskalvon sokeutta ja aiheuttaa vakavan terveyden taakan. Skleriitti on silmän pinnan tulehdussairaus, joka liittyy lievästä vaikeaan kovakalvon tulehdukseen, johon liittyy tai ei ole silmänsisäistä tulehdusta. Vaikea silmän kuivuminen tai skleriitti liittyy autoimmuunisairauksiin, kuten SS, RA, SLE ja muihin sairauksiin. Nykyinen kuivasilmäisyyden hoito ei usein ole riittävän tehokasta (esim. syklosporiini) tai aiheuttaa haittavaikutuksia (esim. kortikosteroidien aiheuttama glaukooma). Kuivasilmäisessä autoimmuunissa silmän pinnassa ja kyynelrauhasessa on immuunivälitteisiä vaurioita. Erilaisissa kuivasilmäsairauden malleissa on osoitettu, että immuunijärjestelmän komponentit, kuten T-solut, makrofagit ja sytokiinit, kuten interleukiini (IL) 1β ja tuumorinekroositekijä (TNF)-α, ovat kriittisiä tämän taudin laukaisemiseksi ja ylläpitämiseksi. . Samoin ei-infektoivien skleriittien hoito on erittäin haastava tilanne kaikille uveiitin asiantuntijoille.

   Silmän pinnan immuunisolut lisääntyvät, kun autoimmuunisairaus on läsnä, joko tietyntyyppisten immuunisolujen osuus tai lukumäärä, esim. monosyyttien tai CD4+ T-solujen määrä voi lisääntyä vakavamman paikallisen tulehduksen ja/tai systeemisen aktiivisuuden esiintyessä. Tietyssä reumatologisessa tilassa voi esiintyä immuunisolujen infiltraatiota. Jos tietyntyyppiset solut (esim. T-solut tai B-solut) ovat vallitsevia systeemisessä sairaudessa, se viittaa siihen, että voidaan käyttää T-solulähestymistapaa (esim. takrolimuusi) tai B-solulähestymistapaa (esim. rituksamabi). Vaihtoehtoisesti, jos tietyillä sytokiineilla on päärooli kuivasilmäisyydessä, voidaan käyttää sytokiinisignaloinnin estäjää, kuten JAK-inhibiittoria.

   Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että sarveiskalvon dendriittisolut ja T-solut liittyvät kriittisesti sarveiskalvon hermohermotukseen [1, 2]. Tämä on osoitettu sekä ihmis- että eläintutkimuksissa [1-4]. Samaan aikaan ihmisen sarveiskalvon hermojen ja dendriittisolujen in vivo -kuvausteknologia ja niiden kvantifiointi ovat parantuneet viime aikoina huomattavasti. Tämä on johtanut räjähdysmäiseen kiinnostukseen tämän tekniikan valjastamiseen perifeeristen neuropatioiden korvikemarkkerina ja taustalla olevien mekanismien tutkimiseen [5-27]. Tutkijat ovat aiemmin osoittaneet, että ensimmäisen sukupolven CCM voi kvantifioida Langerhans-solujen (LC:t) esiintymisen ja tiheyden sarveiskalvon Bowmanin kerroksessa diabeetikoilla [28]. Viimeisintä 3. sukupolven HRT III:ta voidaan kuitenkin käyttää Langerhansin solujen (LC:t) luokittelemiseen ja kvantifiointiin kypsiksi fenotyypeiksi (dendriittisolut, joissa on pitkiä prosesseja) tai epäkypsiksi fenotyypeiksi (ei-dendriittisoluista, joista puuttuu soludendriittejä), jotta saadaan tietoa immuunijärjestelmän muutoksista vivo [29]. Äskettäisessä diabeettisilla hiirillä tehdyssä kokeellisessa tutkimuksessa on käytetty CCM:ää osoittamaan, että suora kosketus DC:iden ja sarveiskalvon hermojen välillä voi laukaista hermosäikevaurioita [30].

   Tieteellisen tiedon aukko: Tutkijat ovat osoittaneet, että tulehdusta edistävät sytokiinit ovat kohonneet kuivasilmäisillä ihmisillä; immuunisolut voivat erittää monia näistä. He havaitsivat alustavissa virtaussytometrisissa tutkimuksissa, että CD4+ T-solut, CD19+ B-solut, CD14+-monosyytit ja CD1c-dendriittisolut voidaan määrittää käyttämällä minimaalisesti invasiivisia impressiokalvoja (Eyeprim)[31]. Täydellistä immuunisolujen alajoukkoa, joka aktivoituu silmän pinnalla kuivassa silmässä ja erilaisissa reumatologisissa sairauksissa, ei tunneta. Näiden solujen osuutta kuivasilmän vaikeusasteesta ja autoimmuunisairauden erilaisesta systeemisestä aktiivisuudesta ei ole arvioitu. Lisäksi on epävarmaa, onko sarveiskalvon hermotuksen eheys myös kyynelten toiminnan määräävä tekijä potilailla, joilla on systeeminen autoimmuunisairaus.

   Tutkimusryhmä on tehnyt monia kliinisiä tutkimuksia ja kuvantamistutkimuksia ihmisen silmän pinnasta. Tämä sisältää mittaukset Oculuksella (ei-invasiiviset kyynelten hajoamisajat), värjäyksen jne. ja sytokiinien mittaamisen käyttämällä multiplex-helmipohjaista sandwich-immunofluoresenssimääritystä[32-38]

   Alustavat tutkimukset Tutkimusryhmä on myös optimoinut sidekalvon immuunisolujen Eyeprim-kokoelman ja analyysimenetelmän käyttämällä immuunimarkkeripaneelia Amnisilla [31], joka on suhteellisen uusi virtaussytometria (kuva 1) yhdistettynä mikroskopiaan (kuva 2). Amnis-tekniikan etuna on analysoitujen solujen suora visualisointi signaalien yhteispaikantamisen mahdollistamiseksi. He ovat julkaisseet solumorfologisten parametrien analyysin validiteetin Amnis-ohjelmistolla verrattuna ihmisen luokitukseen [31]. Lisäksi he ovat myös käyttäneet tavanomaista virtaussytometriaa (BD FACS) CD3:n, CD4:n, CD8:n, CCR7:n, CXCR3:n, CD109:n ja CD63:n värjäytymisen kvantifiointiin (tietoja ei näytetä).

   Yhteistyössä ENA-tiimin kanssa heidän tiiminsä on koulutettu kuvien ottamiseen CCM:n avulla, mikä mahdollistaa sarveiskalvon hermojen ja dendriittisolujen kvantifioinnin [1, 2, 4, 9, 10, 13, 14, 16, 21, 27] (Kuva 3 ). Sarveiskalvon subbaalinen hermosäikeiden tiheys, sarveiskalvon hermosäikeiden tiheys, sarveiskalvon hermosäikeiden pituus ja mutkaisuus (kuva 3, 4) kvantifioidaan käyttämällä sekä manuaalista (CCMetrics) että automaattista (ACCMetrics) kuva-analyysiohjelmistoa, jonka ENA-tiimi on kehittänyt. Subbaal kypsien ja epäkypsien dendriittisolujen tiheys ja jakautuminen suhteessa sarveiskalvon hermoihin määritetään.

   Yhteistyökumppanit, professori Malik ja tohtori Petropoulos johtavat varhaisen neuropatian arviointia (ENA-tiimi-http://qatar-weill.cornell.edu/research/faculty/eng/index.html) ja ovat olleet edelläkävijöitä in vivo CCM:n käytössä. nopeana, ei-invasiivisena oftalmisena instrumenttina diabeettisten ja muiden perifeeristen neuropatioiden seurantaan. He osallistuvat aktiivisesti koulutukseen ja optimaalisen kuvankaappauksen valvontaan ja tarjoavat tarvittavat ohjelmistot ja lisenssioikeudet yksityiskohtaisen kvantifioinnin ja tulkinnan mahdollistamiseksi [9, 10, 12-14, 16, 17, 20, 21, 23-27].

2. HYPOTEESI JA TAVOITTEET Pitkän aikavälin kokonaistavoite: Löytää turvallinen ja tehokas hoito silmän pintatulehdukselle ja määritellä silmän pinnan käyttöaiheet immuunijärjestelmään kohdistuvien lääkkeiden kliiniseen käyttöön reumatologisissa sairauksissa.

   Kliiniset/terveydenhuollon vaikutukset: CCM:n käytöstä autoimmuunisairaudessa on monia etuja. CCM mahdollistaa nopean, ei-invasiivisen kuvantamisen sarveiskalvon hermoista ja dendriittisoluista tulehduksen tason ja sen seurausten määrittämiseksi autoimmuunisairauksissa. Tämä mahdollistaa aikaisemman diagnoosin, riskien kerrostumisen ja oikea-aikaisemman puuttumisen reumatologiaklinikoilla, mikä tehostaa autoimmuunipotilaiden monitieteistä hoitoa. Tutkija rakentaa normatiivisen tietokannan (joko etnisiä tai paikallisia ikäkohtaisia ​​tietoja lukukeskuksesta) käyttämällä tätä tutkimusta alustana rekrytoidakseen lisää potilaita.

   Perustieteelliset vaikutukset: Edistetään sarveiskalvon hermojen ja kyynelten toiminnan/immunologian välisen suhteen ymmärtämistä.

   Lyhyen aikavälin tavoitteet: tutkijat ehdottavat valtakunnallista tutkimusta yhteistyössä Tan Tock Seng -sairaalan kanssa kliinisten piirteiden ja sidekalvon immuunisolujen tutkimiseksi potilailla, joilla on silmän pinnan tulehdussairaus, johon liittyy systeeminen autoimmuunisairaus tai kollageeniverisuonisairaus tai ei.

   Akateemiset tavoitteet: Tavoitteena:

   • Paranna monitieteistä yhteistyötä SERI:n ja S Albanin välillä STIIC:ltä (soluanalyysi)
   • Rakenna uusia yhteistyömuotoja (TTSH-silmälääkäri tohtori R Agrawal)
   • Lisää arvoa/synergiaa tällä hetkellä hyväksytystä rahoituksesta: SERI-pilottiavustus (pilottihenkilöiden rekrytointi ja työkalujen optimointi),
   • Kilpaile tulevasta rahoituksesta, NMRC STAR -palkinnosta, CS:stä tai CBIRG:stä.

   Odotetut löydöt:

   • Reumatologisten sairauksien eri vaikeusaste, kuivasilmäisyyden oireet, kyynelten toiminta, NIKBUT ja sarveiskalvon värjäytyminen voivat korreloida sarveiskalvon hermo- ja dendriitti-/ei-dendriittisoluvaurioiden kanssa.
   • Kyynelsytokiinit voivat korreloida sarveiskalvon hermon ja dendriittisten/ei-dendriittisolujen vikojen kanssa.
   • Muutos T-solujen tai muiden solujen, kuten sidekalvon dendriittisolujen, tiheydessä ja alatyypeissä (impressiosytologia) voi korreloida sarveiskalvon hermo- ja dendriitti-/ei-dendriittisoluvaurioiden kanssa.

   2.3 Mahdolliset riskit ja hyödyt: 2.3.1 Mahdolliset riskit

   • On mahdollista, että sidekalvon solujen näytteenoton aikana jäljennöskalvoa käyttämällä saattaa esiintyä lievää epämukavuutta
   • Pientä epämukavuutta tai punoitusta kyynelnesteen kerääntymisestä (Schirmer-testi)
   • Harvoin sarveiskalvon epiteelin vika voi ilmetä in vivo konfokaalimikroskopiassa, mutta se paranee yleensä 1-2 päivässä. Sarveiskalvon epiteelin vika tarkoittaa, että sarveiskalvon kerros on rikki, kuten hankauksen aikana tapahtui.
   • Pistelevä tunne paikallispuudutteen (Alcaine) seurauksena

   2.3.2 Mahdolliset edut Ymmärtämällä paremmin erilaisten tulehdusvälittäjien läsnäoloa tutkijat voivat saada lisätietoa monimutkaisesta prosessista, joka tapahtuu autoimmuunisairauksia sairastavilla potilailla.

3. TUTKIMUSOPULAATIO 3.1 Ilmoittautuvien koehenkilöiden lukumäärä ja luonne. Tutkijat rekrytoivat potilaita, joilla on kolme erityistä reumatologista diagnoosia ja kontrollia

   • SS (n=40), RA (n=40), SLE (n=40)
   • Terveet ikää/etnistä alkuperää/sukupuolta vastaavat vertailukohteet (n=40)

   Näytteen kokonaiskoko: 160

4. TUTKIMUKSEN SUUNNITTELU Tämä on poikkileikkaustutkimus, johon osallistuu 160 osallistujaa. Opintojen kesto: Yksi vierailu, rekrytoinnin kesto: 1 vuosi

4.1.1 Seulontakäynti ja menettelyt Seulontakäynti ja toimenpiteet tehdään erillisenä päivänä. TTSH:sta lähetetyille osallistujille varataan aika tulla SERI:lle silmätutkimuksiin. Toimenpidepäivänä SERI-koordinaattori seuloi kelvolliset aiheet esittämällä heille kysymyksiä sisällyttämisen ja poissulkemisen tarkistuslistan perusteella. Jos todetaan kelvollisiksi ja osallistujat ovat kiinnostuneita, suostumus otetaan SERI:ssä ja SERI-optometristi jatkaa silmäarviointeja.

4.1.2 Tutkimusmenettelyt

Tutkimukset tekevät SERI-tutkimusryhmän jäsenet. Luettelo vaadituista kokeista näkyy:

1. Kuivien silmien oireet (SPEED-kysely)
2. Ei-invasiivinen kyynelten katkeamisaika (NIKBUT) – Oculus K5M
3. Sidekalvon punoitus - Oculus K5M
4. Kyynelkokoelma Schirmers-nauhalta
5. Impression sytologia - käyttämällä EyePrim sidekalvokalvoja
6. Sarveiskalvon fluoreseiinivärjäys - Oculus K5M
7. In vivo sarveiskalvon konfokaalinen mikroskopia (CCM)
8. Kliinisen tiedon haku osallistujilta