Explorando as assinaturas de células imunes na autoimunidade e na síndrome do olho seco

1. ANTECEDENTES E FUNDAMENTAÇÃO

   1.1 Introdução Geral

   Doenças da superfície ocular, especialmente olho seco e esclerite, comumente afetam pacientes com doenças autoimunes. As células imunes da superfície ocular estão aumentadas na doença autoimune; no entanto, o subconjunto completo de células imunes ativadas é desconhecido. Estudos experimentais recentes mostram que as células dendríticas e as células T na córnea estão criticamente associadas à inervação do nervo corneano. A microscopia confocal da córnea (CCM) permite imagens rápidas e não invasivas in vivo de células dendríticas e nervos da córnea. Os investigadores se propõem a investigar como a saúde da superfície ocular, as células imunes conjuntivais e a morfologia do nervo corneano/células dendríticas interagem em 3 condições reumatológicas: Síndrome de Sjögren (SS), Artrite reumatóide (AR), Lúpus eritematoso sistêmico (LES).

   Os estudos preliminares de citometria de fluxo mostram que várias células imunes (por exemplo: células T, células B e células dendríticas) podem ser quantificadas usando membranas de impressão minimamente invasivas (Eyeprim). Clinicamente, a equipe de pesquisa tem experiência na medição de características de inflamação da superfície ocular (vermelhidão conjuntival, tempos de ruptura lacrimal) com o Oculus keratograph5M. Os investigadores também pretendem colher células imunes conjuntivais usando citologia de impressão e quantificar tipos de células específicas com citometria de fluxo. A morfologia do nervo corneano e a densidade e distribuição das células dendríticas serão avaliadas usando CCM; em colaboração com o grupo pioneiro desta técnica.

   Os investigadores antecipam que as alterações nos parâmetros do nervo da córnea e das células dendríticas estarão correlacionadas com a ativação/inflamação imunológica, deterioração da função lacrimal e aumento da gravidade sistêmica da doença reumatológica. Além disso, o investigador levanta a hipótese de que quanto menor a densidade do nervo corneano, maior o número de células dendríticas da córnea e células inflamatórias da conjuntiva. Estudar essas relações pode permitir uma melhor compreensão mecanicista da ativação imune sistêmica e corneana local e o desenvolvimento de um marcador substituto oftálmico não invasivo de ativação de células dendríticas e perda de fibras nervosas para auxiliar no diagnóstico precoce, estratificação de risco e desenvolvimento de novas terapias em nosso meio. pacientes autoimunes com olho seco grave.

   1.2 Justificativa para o Objetivo do Estudo

   O olho seco, um tipo de inflamação crônica da superfície ocular, é altamente prevalente e contribui para a cegueira da córnea e impõe um fardo grave à saúde. A esclerite é um distúrbio inflamatório da superfície ocular associado à inflamação leve a grave da esclera com ou sem inflamação intraocular. Olho seco grave ou esclerite está associado a doenças autoimunes como SS, AR, LES e outras condições. O tratamento atual do olho seco geralmente não é eficaz o suficiente (por exemplo, ciclosporina) ou causa efeitos adversos (por exemplo, glaucoma induzido por corticosteroides). No olho seco autoimune, há dano imunomediado à superfície ocular e à glândula lacrimal. Em vários modelos de olho seco, foi demonstrado que componentes do sistema imunológico, como células T, macrófagos e citocinas, como interleucina (IL) 1β e fator de necrose tumoral (TNF)-α, são críticos para desencadear e manter esta doença . Da mesma forma, o tratamento de escleritos não infecciosos é uma situação muito desafiadora para todos os especialistas em uveíte.

   As células imunes da superfície ocular aumentam quando a doença autoimune está presente, seja a proporção ou o número de um tipo particular de célula imune, por exemplo. monócitos ou células T CD4+ podem estar aumentados na presença de inflamação local mais grave e/ou atividade sistêmica. Uma assinatura de infiltração de células imunes pode estar presente em uma condição reumatológica particular. Se certos tipos de células (por exemplo, células T ou células B) forem predominantes na doença sistêmica, isso sugere que uma abordagem de células T (por exemplo, tacrolimus) ou abordagem de células B (por exemplo, rituxamab) pode ser usada. Alternativamente, se certas citocinas desempenham um papel importante no olho seco, um inibidor da sinalização de citocinas, como um inibidor de JAK, pode ser usado.

   Estudos recentes mostraram que as células dendríticas e as células T na córnea estão criticamente associadas à inervação do nervo corneano [1, 2]. Isso foi demonstrado em estudos com humanos e animais [1-4]. Ao mesmo tempo, a tecnologia para geração de imagens in vivo de nervos corneanos humanos e células dendríticas e sua quantificação melhoraram muito recentemente. Isso levou a uma explosão de interesse em aproveitar essa tecnologia como um marcador substituto para neuropatias periféricas e para explorar os mecanismos subjacentes [5-27]. Os investigadores mostraram anteriormente que a CCM de primeira geração pode quantificar a presença e a densidade das células de Langerhans (LCs) na camada de Bowman da córnea em pacientes com diabetes [28]. No entanto, o mais recente HRT III de 3ª geração pode ser usado para classificar e quantificar as células de Langerhans (LCs) em um fenótipo maduro (células dendríticas com processos longos) ou um fenótipo imaturo (células não dendríticas sem dendritos celulares) para fornecer informações sobre alterações imunológicas em vivos [29]. Um estudo experimental recente em camundongos diabéticos usou CCM para mostrar que o contato direto entre CDs e os nervos da córnea pode desencadear danos nas fibras nervosas [30].

   Lacuna no conhecimento científico: Pesquisadores demonstraram que as citocinas pró-inflamatórias estão elevadas nas lágrimas de humanos com olho seco; muitos destes podem ser secretados por células imunes. Eles descobriram em estudos preliminares de citometria de fluxo que células T CD4+, células B CD19+, monócitos CD14+, células dendríticas CD1c podem ser quantificadas usando membranas de impressão minimamente invasivas (Eyeprim)[31]. O subconjunto completo de células imunológicas ativadas na superfície ocular no olho seco e em várias condições reumatológicas não é conhecido. As proporções dessas células em diferentes gravidades de olho seco e diferentes atividades sistêmicas de doenças autoimunes não foram avaliadas. Além disso, é incerto se a integridade da inervação da córnea também é um determinante da função lacrimal em pacientes com doença sistêmica autoimune.

   O grupo de pesquisa realizou muitos ensaios clínicos e estudos de imagem da superfície ocular humana. Isso inclui medições com Oculus (tempos de ruptura lacrimal não invasivos), coloração, etc., e a medição de citocinas usando o ensaio de imunofluorescência sanduíche baseado em esferas multiplex[32-38]

   Estudos preliminares O grupo de pesquisa também otimizou a coleta Eyeprim de células imunológicas conjuntivais e o método de análise usando um painel de marcadores imunológicos com Amnis [31], um tipo relativamente novo de citometria de fluxo (Figura 1) acoplado à microscopia (Figura 2). A vantagem da técnica Amnis é a visualização direta das células analisadas para permitir a co-localização dos sinais. Eles publicaram sobre a validade da análise de parâmetros morfológicos celulares usando o software Amnis, em comparação com um classificador humano [31]. Além disso, eles também usaram a citometria de fluxo convencional (BD FACS) para quantificar a coloração de CD3, CD4, CD8, CCR7, CXCR3, CD109 e CD63 (dados não mostrados).

   Em colaboração com a equipe da ENA, sua equipe foi treinada na aquisição de imagens usando CCM para permitir a quantificação de nervos corneanos e células dendríticas [1, 2, 4, 9, 10, 13, 14, 16, 21, 27](Figura 3 ). A densidade das fibras do nervo corneano subbasal, a densidade dos ramos do nervo corneano, o comprimento das fibras nervosas da córnea e a tortuosidade (Figura 3, 4) serão quantificados usando software de análise de imagem manual (CCMetrics) e automatizado (ACCMetrics), desenvolvido pela equipe da ENA. Serão quantificadas a densidade e distribuição de células dendríticas sub-basais maduras e imaturas em relação aos nervos corneanos.

   Os colaboradores, Prof Malik e Dr. Petropoulos, estão liderando a avaliação de neuropatia precoce (equipe ENA-http://qatar-weill.cornell.edu/research/faculty/eng/index.html) e foram pioneiros no uso de CCM in vivo como um instrumento oftálmico rápido e não invasivo para monitorar neuropatias diabéticas e outras neuropatias periféricas. Eles se envolverão ativamente no treinamento e na supervisão da captura ideal de imagens e fornecerão o software necessário e os privilégios de licenciamento para permitir quantificação e interpretação detalhadas [9, 10, 12-14, 16, 17, 20, 21, 23-27].

2. HIPÓTESE E OBJETIVOS Objetivo geral de longo prazo: Descobrir um tratamento seguro e eficaz para a inflamação da superfície ocular e definir as indicações da superfície ocular para uso clínico de medicamentos direcionados ao sistema imunológico em doenças reumatológicas.

   Implicações clínicas/saúde: Existem muitos benefícios no uso de CCM em doenças autoimunes. A CCM permite imagens rápidas e não invasivas dos nervos da córnea e células dendríticas para determinar o nível de inflamação e suas consequências em doenças autoimunes. Isso permitirá um diagnóstico mais precoce, estratificação de risco e intervenção mais oportuna nas clínicas de reumatologia, aprimorando o atendimento multidisciplinar de pacientes autoimunes. O investigador construirá um banco de dados normativo (dados étnicos ou específicos da idade local de um centro de leitura) usando este estudo como uma plataforma para recrutar mais pacientes.

   Implicações científicas básicas: compreensão avançada da relação entre os nervos da córnea e a função lacrimal/imunologia.

   Objetivos de curto prazo: os pesquisadores propõem um estudo nacional em colaboração com o Hospital Tan Tock Seng para estudar as características clínicas e as células imunes conjuntivais em pacientes com doença inflamatória da superfície ocular com ou sem doença autoimune sistêmica ou vascular do colágeno associada.

   Objetivos Académicos: Pretende-se:

   • Melhorar as colaborações multidisciplinares, entre SERI e S Albani do STIIC (análise celular)
   • Construir novas colaborações (TTSH oftalmologista Dr. R Agrawal)
   • Aumentar o valor/sinergia do financiamento atualmente aprovado: subvenção piloto SERI (recrutamento de participantes piloto e otimização de ferramentas),
   • Concorra a financiamento futuro, prêmio NMRC STAR, CS ou CBIRG.

   Descobertas esperadas:

   • Diferentes gravidades sistêmicas das doenças reumatológicas, sintomas de olho seco, função lacrimal, NIKBUT e coloração da córnea podem se correlacionar com defeitos do nervo corneano e células dendríticas/não dendríticas.
   • As citocinas lacrimais podem correlacionar-se com defeitos do nervo corneano e células dendríticas/não dendríticas.
   • A alteração na densidade e nos subtipos de células T ou outras células, como as dendríticas na conjuntiva (citologia de impressão), podem correlacionar-se com defeitos do nervo corneano e células dendríticas/não dendríticas.

   2.3 Riscos e Benefícios Potenciais: 2.3.1 Riscos Potenciais

   • É possível que haja algum leve desconforto durante a amostragem de células conjuntivais usando a membrana de impressão
   • Algum leve desconforto ou vermelhidão devido à coleta de fluido lacrimal (teste de Schirmer)
   • Raramente um defeito epitelial da córnea pode ocorrer a partir da microscopia confocal in vivo, mas isso geralmente cicatriza em 1-2 dias. Defeito epitelial da córnea significa que uma camada da córnea está quebrada, semelhante ao que aconteceu durante uma abrasão.
   • Sensação de picada como resultado de anestésico local (Alcaína)

   2.3.2 Benefícios potenciais Com uma maior compreensão da presença de vários mediadores inflamatórios, os investigadores podem obter mais informações sobre o complexo processo que ocorre em pacientes com doenças autoimunes.

3. POPULAÇÃO DO ESTUDO 3.1 Liste o número e a natureza dos indivíduos a serem inscritos. Os investigadores recrutarão pacientes com 3 diagnósticos reumatológicos específicos e controles

   • SS (n=40), RA (n=40), LES (n=40)
   • Sujeitos de controle pareados por idade/etnia/sexo saudáveis ​​(n=40)

   Tamanho total da amostra: 160

4. DESENHO DO ESTUDO Este é um estudo transversal envolvendo 160 participantes. Duração do estudo: Uma visita, duração do recrutamento: 1 ano

4.1.1 Visita de triagem e procedimentos A visita de triagem e os procedimentos serão realizados em um dia separado. Os participantes encaminhados do TTSH terão um horário para comparecer ao SERI para os exames oculares. No dia do procedimento, o coordenador do SERI fará a triagem dos sujeitos elegíveis, fazendo-lhes algumas perguntas com base na lista de verificação de inclusão e exclusão. Se for considerado elegível e os participantes estiverem interessados, o consentimento será obtido no SERI e o optometrista do SERI prosseguirá com as avaliações oculares.

4.1.2 Procedimentos do Estudo

Os exames serão feitos pelos membros da equipe de estudo do SERI. A lista de exames necessários é mostrada:

1. Sintomas de olho seco (questionário SPEED)
2. Tempo de rompimento lacrimal não invasivo (NIKBUT) - Oculus K5M
3. Vermelhidão conjuntival - Oculus K5M
4. Coleção de lágrimas da tira de Schirmers
5. Citologia de impressão - usando membranas conjuntivais EyePrim
6. Coloração de fluoresceína da córnea - Oculus K5M
7. Microscopia confocal corneana in vivo (CCM)
8. Recuperação de informações clínicas dos participantes