Az immunsejt aláírások feltárása autoimmunitásban és száraz szem szindrómában

1. HÁTTÉR ÉS INDOKOLÁS

   1.1 Általános bevezető

   A szemfelszín betegségei, különösen a szemszárazság és a szkleritis, gyakran érintik az autoimmun betegségekben szenvedő betegeket. A szemfelszíni immunsejtek megnövekednek autoimmun betegségekben; azonban az aktivált immunsejtek teljes alcsoportja nem ismert. A legújabb kísérleti vizsgálatok azt mutatják, hogy a szaruhártya dendrites sejtjei és T-sejtjei kritikusan összefüggenek a szaruhártya ideg beidegzésével. A szaruhártya konfokális mikroszkópia (CCM) lehetővé teszi a dendritikus sejtek és a szaruhártya idegeinek gyors, nem invazív in vivo képalkotását. A kutatók azt javasolják, hogy vizsgálják meg, hogyan hatnak egymásra a szemfelszín egészsége, a kötőhártya immunsejtek és a szaruhártya ideg/dendritesejtes morfológiája három reumatológiai állapot esetén: Sjogren-szindróma (SS), rheumatoid arthritis (RA), szisztémás lupus erythematosus (SLE).

   Az előzetes áramlási citometriás vizsgálatok azt mutatják, hogy különféle immunsejtek (pl. T-sejtek, B-sejtek és dendritikus sejtek) mennyiségileg meghatározhatók minimálisan invazív lenyomatmembránok (Eyeprim) segítségével. Klinikailag a kutatócsoport tapasztalattal rendelkezik a szemfelszíni gyulladás jellemzőinek (kötőhártya vörössége, könnyezési idők) mérésében az Oculus keratograph5M segítségével. A kutatók célja továbbá a kötőhártya immunsejtek begyűjtése lenyomat-citológia segítségével, és specifikus sejttípusok mennyiségi meghatározása áramlási citometriával. A szaruhártya ideg morfológiáját és a dendrites sejtek sűrűségét és eloszlását CCM segítségével értékeljük; együttműködve azzal a csoporttal, akik úttörői voltak ennek a technikának.

   A kutatók arra számítanak, hogy a szaruhártya ideg- és dendritesejt-paramétereinek változásai összefüggésben állnak az immunaktivációval/gyulladással, a könnyfunkció romlásával és a reumatológiai betegség fokozott szisztémás súlyosságával. Ezenkívül a kutató feltételezi, hogy minél alacsonyabb a szaruhártya idegsűrűsége, annál nagyobb a szaruhártya dendritikus sejtjei és a kötőhártya gyulladásos sejtjei. Ezen összefüggések tanulmányozása lehetővé teheti a szaruhártya lokális és szisztémás immunaktivációjának jobb mechanisztikus megértését, valamint a dendritesejt-aktiváció és az idegrostvesztés non-invazív szemészeti helyettesítő markerének kifejlesztését, amely elősegíti a korábbi diagnózist, a kockázati rétegződést és új terápiák kifejlesztését. súlyos száraz szemű autoimmun betegek.

   1.2 A tanulmányi cél szempontjából ésszerű

   A szemszárazság, a krónikus szemfelszíni gyulladás egyik fajtája, nagyon elterjedt, hozzájárul a szaruhártya vakságához, és súlyos egészségügyi terhet ró. A scleritis egy szemfelszíni gyulladásos rendellenesség, amely a sclera enyhe vagy súlyos gyulladásához kapcsolódik intraokuláris gyulladással vagy anélkül. A súlyos szemszárazság vagy szkleritisz olyan autoimmun betegségekkel jár, mint az SS, RA, SLE és más állapotok. A szemszárazság jelenlegi kezelése gyakran nem elég hatékony (pl. ciklosporin), vagy káros hatásokat okoz (pl. kortikoszteroidok által kiváltott glaukóma). Autoimmun száraz szem esetén a szem felszíne és a könnymirigy immunmediált károsodása következik be. A száraz szem betegség különböző modelljeiben kimutatták, hogy az immunrendszer olyan összetevői, mint a T-sejtek, makrofágok és citokinek, mint például az interleukin (IL) 1β és a tumor nekrózis faktor (TNF)-α kritikus fontosságúak e betegség kiváltásában és fenntartásában. . Hasonlóképpen, a nem fertőző scleritek kezelése nagy kihívást jelent minden uveitisz-specialista számára.

   A szemfelszíni immunsejtek száma megnövekszik, ha autoimmun betegség van jelen, akár egy bizonyos típusú immunsejt aránya vagy száma, pl. A monociták vagy a CD4+ T-sejtek megnövekedhetnek súlyosabb lokális gyulladás és/vagy szisztémás aktivitás esetén. Egy adott reumatológiai állapot esetén immunsejt-infiltráció jele lehet. Ha bizonyos típusú sejtek (például T-sejtek vagy B-sejtek) vannak túlsúlyban a szisztémás betegségben, ez arra utal, hogy T-sejtes megközelítést (például takrolimusz) vagy B-sejtes megközelítést (például rituxamab) lehet alkalmazni. Alternatív megoldásként, ha bizonyos citokinek fő szerepet játszanak a szemszárazságban, a citokin jelátvitel gátlója, például JAK-inhibitor használható.

   A legújabb tanulmányok kimutatták, hogy a szaruhártya dendritikus sejtek és T-sejtek kritikus kapcsolatban állnak a szaruhártya ideg beidegzésével [1, 2]. Ezt humán és állatkísérletek is kimutatták [1-4]. Ugyanakkor az emberi szaruhártya idegeinek és dendrites sejtjeinek in vivo képalkotási technológiája és ezek mennyiségi meghatározása az utóbbi időben nagymértékben javult. Ez robbanásszerűen megnőtt az érdeklődés e technológia perifériás neuropátiák helyettesítő markereként való felhasználása és a mögöttes mechanizmusok feltárása iránt [5-27]. A kutatók korábban kimutatták, hogy az első generációs CCM képes számszerűsíteni a Langerhans-sejtek (LC-k) jelenlétét és sűrűségét a szaruhártya Bowman-rétegében cukorbeteg betegeknél [28]. A legújabb, 3. generációs HRT III azonban felhasználható a Langerhans-sejtek (LC-k) érett fenotípusba (hosszú folyamatokat hordozó dendritesejt) vagy éretlen fenotípusba (nem-dendrites sejtek, amelyekben nincsenek sejtdendritek) osztályozására és mennyiségi meghatározására, hogy betekintést nyújtson az immunrendszer változásaiba. vivo [29]. Egy nemrégiben végzett, cukorbeteg egereken végzett kísérleti vizsgálatban a CCM segítségével kimutatták, hogy a DC-k és a szaruhártya idegei közötti közvetlen érintkezés idegrostkárosodást válthat ki [30].

   Hiány a tudományos ismeretek között: A kutatók kimutatták, hogy a gyulladást okozó citokinek szintje megemelkedett a száraz szemű emberek könnyeiben; ezek közül sokat az immunsejtek szekretálhatnak. Előzetes áramlási citometriás vizsgálatok során megállapították, hogy a CD4+ T-sejtek, CD19+ B-sejtek, CD14+-monociták, CD1c dendritikus sejtek mennyiségileg meghatározhatók minimálisan invazív lenyomatmembránok (Eyeprim) segítségével[31]. Száraz szem és különféle reumatológiai állapotok esetén a szem felszínén aktiválódó immunsejtek teljes csoportja nem ismert. Ezeknek a sejteknek az arányát a szemszárazság különböző súlyossága és az autoimmun betegségek különböző szisztémás aktivitása esetén nem értékelték. Továbbá bizonytalan, hogy a szaruhártya beidegzés integritása a könnyfunkciót is meghatározó tényező-e az autoimmun szisztémás betegségben szenvedő betegeknél.

   A kutatócsoport számos klinikai vizsgálatot és képalkotó vizsgálatot végzett az emberi szem felszínén. Ez magában foglalja az Oculus-szal végzett méréseket (nem invazív könnyfelszakadási idők), a festést stb., valamint a citokinek mérését a multiplex gyöngy alapú szendvics immunfluoreszcencia vizsgálattal[32-38].

   Előtanulmányok A kutatócsoport a kötőhártya immunsejtjeinek Eyeprim gyűjteményét és az elemzési módszert is optimalizálta egy immunmarker panel segítségével Amnis [31] segítségével, egy viszonylag új típusú áramlási citometriával (1. ábra) és mikroszkóppal (2. ábra). Az Amnis technika előnye az elemzett sejtek közvetlen megjelenítése, amely lehetővé teszi a jelek együttes lokalizációját. Közzétették az Amnis szoftverrel végzett sejtmorfológiai paraméterek elemzésének érvényességét egy humán osztályozóval összehasonlítva [31]. Ezenkívül hagyományos áramlási citometriát (BD FACS) is alkalmaztak a CD3, CD4, CD8, CCR7, CXCR3, CD109 és CD63 festődés mennyiségi meghatározására (az adatokat nem mutatjuk be).

   Az ENA-csapattal együttműködve csapatukat kiképezték a CCM-et használó képalkotásra, amely lehetővé teszi a szaruhártya idegeinek és a dendritikus sejtek számszerűsítését [1, 2, 4, 9, 10, 13, 14, 16, 21, 27] (3. ábra). ). A szubbazális szaruhártya idegrostsűrűséget, a szaruhártya idegszálak sűrűségét, a szaruhártya idegrostjának hosszát és a kanyargósságot (3. és 4. ábra) az ENA csapata által kifejlesztett manuális (CCMetrics) és automatizált (ACCMetrics) képelemző szoftverrel is számszerűsítik. Számszerűsíteni kell a szubbazális érett és éretlen dendrites sejtek sűrűségét és eloszlását a szaruhártya idegeihez viszonyítva.

   A munkatársak, Prof Malik és Dr. Petropoulos vezetik a korai neuropátia felmérést (ENA team-http://qatar-weill.cornell.edu/research/faculty/eng/index.html), és úttörő szerepet játszottak az in vivo CCM használatában. gyors, non-invazív szemészeti eszközként a diabéteszes és egyéb perifériás neuropátiák monitorozására. Aktívan részt vesznek a képzésben és az optimális képrögzítés felügyeletében, és biztosítják a szükséges szoftvereket és licencjogokat a részletes számszerűsítés és értelmezés lehetővé tételéhez [9, 10, 12-14, 16, 17, 20, 21, 23-27].

2. HIPOTÉZIS ÉS CÉLKITŰZÉSEK Általános hosszú távú célkitűzés: A szemfelszíni gyulladások biztonságos és hatékony kezelésének felfedezése és a szemfelszíni indikációk meghatározása az immunrendszert célzó gyógyszerek klinikai alkalmazásához reumatológiai betegségekben.

   Klinikai/egészségügyi vonatkozások: Számos előnnyel jár a CCM alkalmazása autoimmun betegségekben. A CCM lehetővé teszi a szaruhártya idegeinek és a dendritikus sejtek gyors, non-invazív képalkotását a gyulladás mértékének és következményeinek meghatározására autoimmun betegségekben. Ez lehetővé teszi a korábbi diagnózist, kockázati rétegződést és időben történő beavatkozást a reumatológiai klinikákon, javítva az autoimmun betegek multidiszciplináris ellátását. A vizsgáló egy normatív adatbázist (egy olvasóközpont etnikai vagy helyi életkor-specifikus adatait) fog létrehozni úgy, hogy ezt a tanulmányt platformként használja fel több beteg toborzására.

   Alapvető tudományos vonatkozások: A szaruhártya idegei és a könnyfunkció/immunológia közötti kapcsolat jobb megértése.

   Rövid távú célok: a kutatók országos tanulmányt javasolnak a Tan Tock Seng Kórházzal együttműködve a klinikai jellemzők és a kötőhártya immunsejtjei tanulmányozására olyan betegeknél, akik szemfelszíni gyulladásos betegségben szenvednek, társuló szisztémás autoimmun vagy kollagén érbetegséggel vagy anélkül.

   Tanulmányi célok: Cél:

   • Fokozza a multidiszciplináris együttműködést a SERI és az S Albani között a STIIC-től (sejtelemzés)
   • Építsen új együttműködéseket (TTSH szemész Dr. R Agrawal)
   • A jelenleg jóváhagyott finanszírozás értékének/szinergiájának növelése: SERI kísérleti támogatás (kísérleti résztvevők toborzása és eszközök optimalizálása),
   • Versenyezz a jövőbeli finanszírozásért, az NMRC STAR díjért, a CS-ért vagy a CBIRG-ért.

   Várható leletek:

   • A reumatológiai betegségek különböző szisztémás súlyossága, a szemszárazság tünetei, a könnyfunkció, a NIKBUT és a szaruhártya festődés korrelálhat a szaruhártya ideg- és dendrites/nem-dendrites sejthibáival.
   • A könny citokinek korrelálhatnak a szaruhártya idegeivel és a dendrites/nem dendrites sejthibákkal.
   • A T-sejtek vagy más sejtek, például a kötőhártya dendritjei sűrűségének és altípusainak változása (impressziós citológia) korrelálhat a szaruhártya idegével és a dendrites/nem-dendrites sejthibákkal.

   2.3 Lehetséges kockázatok és előnyök: 2.3.1 Potenciális kockázatok

   • Előfordulhat, hogy a kötőhártya sejtekből a lenyomatmembrán segítségével történő mintavétel során enyhe kényelmetlenség tapasztalható
   • Enyhe kellemetlen érzés vagy bőrpír a könnyfolyadék gyűjtése miatt (Schirmer teszt)
   • Ritkán in vivo konfokális mikroszkóppal szaruhártya hámhiba léphet fel, de ez általában 1-2 napon belül meggyógyul. A szaruhártya hámhibája azt jelenti, hogy a szaruhártya egy rétege eltört, hasonlóan ahhoz, ami a kopás során történt.
   • Helyi érzéstelenítés (Alcaine) okozta szúró érzés

   2.3.2 Lehetséges előnyök A különböző gyulladásos mediátorok jelenlétének jobb megértésével a kutatók további betekintést nyerhetnek az autoimmun betegségekben szenvedő betegekben végbemenő összetett folyamatokba.

3. TANULMÁNYOSSÁG 3.1. Sorolja fel a beiratkozandó alanyok számát és jellegét. A vizsgálók 3 specifikus reumatológiai diagnózissal és kontrollal rendelkező betegeket vesznek fel

   • SS (n=40), RA (n=40), SLE (n=40)
   • Egészséges kor/etnikai hovatartozás/nem megfelelő kontrollalanyok (n=40)

   Teljes mintaméret: 160

4. TANULMÁNY TERVEZÉSE Ez egy keresztmetszeti tanulmány 160 résztvevővel. Tanulmányi idő: Egy látogatás, toborzás időtartama: 1 év

4.1.1 Szűrőlátogatás és eljárások A szűrési látogatás és eljárások külön napon történnek. A TTSH-ból beutalt résztvevők kapnak egy időt, hogy a SERI-be jöjjenek a szemvizsgálatra. Az eljárás napján a SERI koordinátor a felvételi és kizárási ellenőrzőlista alapján néhány kérdést feltesz nekik a jogosult alanyok között. Ha megfelelőnek találják, és a résztvevők érdeklődnek, a SERI-nél be kell kérni a hozzájárulást, és a SERI optometristája folytatja a szemvizsgálatot.

4.1.2 Tanulmányi eljárások

A vizsgálatokat a SERI vizsgálati csoport tagjai végzik. A kötelező vizsgálatok listája látható:

1. Száraz szem tünetei (SPEED-kérdőív)
2. Nem invazív könnyezési idő (NIKBUT) – Oculus K5M
3. Kötőhártya vörössége- Oculus K5M
4. Könnygyűjtemény a Schirmers szalagról
5. Impressziós citológia - EyePrim kötőhártya membránok használatával
6. Szaruhártya fluoreszcein festése - Oculus K5M
7. In vivo szaruhártya konfokális mikroszkópia (CCM)
8. Klinikai információk lekérése a résztvevőktől