结合珠蛋白表型与 2 型糖尿病患者血管功能和维生素 E 补充反应的关系：EVAS 试验 (EVAS)

1.0 背景和临床意义 1.1 简介 2 型糖尿病 (DM2) 的发病率在全球和新加坡迅速增长。 DM2 患者发病率和死亡率增加的主要原因是微血管和大血管并发症的发生。 尽管严格的血糖控制已被证明可以减少微血管并发症，但仍然缺乏关于大血管并发症的证据。 加速的动脉粥样硬化是这些患者死亡率和发病率增加的主要原因。 在常规治疗之上评估 DM2 患者控制动脉粥样硬化的新靶点至关重要。 寻找预测糖尿病患者风险增加的新目标或标志物的需求尚未得到满足，我们需要考虑在常规目标之上的替代疗法，以降低这些高危人群患者的风险。

DM2 患者不仅动脉粥样硬化的风险增加，而且还承担更大程度的疾病负担。 内皮功能障碍被认为是对血管造成病理损伤的标志。 高血糖影响与活性氧 (ROS) 生成相关的线粒体、酶促和非酶促途径，导致一氧化氮生物利用度降低和内皮功能障碍，通常表现为内皮依赖性血管舒张减少和内皮衍生调节蛋白血浆水平升高。 此外，DM2 患者以低水平的抗氧化酶和 α-生育酚（维生素 E）的形式损害了抗氧化防御，这可能会阻碍对氧化应激增加的充分补偿。 氧化应激在介导动脉粥样硬化发展中的另一个作用也在氧化假说中得到证实。 在这个模型中，氧化修饰最突出的目标是低密度脂蛋白分子。 氧化的低密度脂蛋白不被低密度脂蛋白受体识别，但很容易被巨噬细胞中的 CD36 清道夫受体途径吸收，导致明显的胆固醇酯积累和泡沫细胞形成。 氧化的低密度脂蛋白是促炎性的，它引起内皮NO合成酶的抑制，促进血管收缩和单核细胞粘附，促进血小板聚集和血栓形成。

Hp表型和氧化组织损伤

触珠蛋白 (Hp) 蛋白是一种抗氧化剂，因为它能够中和血红蛋白 (Hb) 的氧化活性。 在人类中，Hp 的特征是遗传多态性，具有三种结构不同的表型（Hp1-1、Hp 2-1 和 Hp 2-2，这是由于触珠蛋白基因的两个不同等位基因（Hp 1 和 Hp 2）表达所致染色体 16q22。 与 Hp1 等位基因产物相比，Hp2 等位基因的蛋白质产物是一种劣质抗氧化剂。 Hp 1-1 是一个结构明确的小分子 (86kDa)，而 Hp 2-1 的特点是杂聚物 (86-300 kDA)，而 Hp 2-2 形成大分子复合物 (170-1,000 kDa)。

Hp的功能是结合红细胞释放的游离Hb，后者在红细胞自然更新过程中释放到血液中。 由于其血红素铁，游离 Hb 能够引起相当大的氧化组织损伤。 然而，每当 Hb 被释放到循环中时，它会立即以极高的亲和力与 Hp 结合，形成 Hp-Hb 复合物。 这种结合通过阻止血红素铁从 Hb 中释放来抑制 Hb 的氧化潜力。 Hp 通常在血液中以比游离 Hb 多 400 倍的摩尔过量存在，因此 Hp 能够结合在正常红细胞更新期间释放的所有 Hb。 一旦 Hb 与 Hp 结合，它就会通过单核细胞/巨噬细胞上表达的 CD163 清道夫受体迅速从血流中清除，但是，Hp 2-2 表型中 Hp-Hb 复合物的形成和清除受到损害。

源自 Hb 的铁可以催化许多可被 Hp 抑制的氧化反应。

1. 亚铁血红素铁 (Fe2+) 可与过氧化氢反应生成三价血红素 (Fe3+) 和高活性羟基自由基。 通过从多不饱和脂肪酸中提取一个氢原子，羟基自由基可以启动脂质过氧化过程。
2. 亚铁 Hb (Fe2+) 也可以与过氧化氢反应生成亚铁基 Hb (Fe4+)，这是一种高度不稳定的分子，很容易与第二个过氧化氢分子反应生成三价 Hb (Fe3+) 和超氧阴离子。 超氧阴离子的破坏作用是双重的：将 Hb 中的三价铁 (Fe3+) 还原为亚铁 (Fe2+)，从而如反应 1 中所述产生额外的羟基自由基，以及超氧阴离子歧化产生过氧化氢, 再次促进 ROS 的产生。

3. 铁血红蛋白（含 Fe3+），也称为高铁血红蛋白，可以自发转移其血红素部分，导致血红素进入多种亲脂环境，如低密度脂蛋白或细胞膜。 一旦嵌入到新的脂质环境中，血红素铁可以如上所述与过氧化氢或与相邻的脂质过氧化物发生反应，产生自由基级联并导致广泛的脂质氧化。

   作为Hp-Hb复合物的一部分，Hp稳定Hb血红素袋中的血红素，防止Hb引起氧化损伤。 然而，Hp 中和血红素铁的氧化还原活性的程度因 Hp 类型而异。 这已在体外和体内的许多系统中得到证实。 例如，使用亚麻酸的研究表明，Hp 1-1 可防止氧化（二烯形成），这是通过在 232 nm 处的吸光度增加来衡量的，其程度高于 Hp 2-2 。 另一项研究检查了由于血红素从 Hb 转移到 LDL 而导致的 LDL 氧化。 血红素转移是通过淬灭丹酰化低密度脂蛋白发出的荧光信号来测量的。 发现与 Hp 2-2 相比，Hp 1-1 在防止血红素从 Hb 转移方面更出色。

   Hp 表型和心血管风险研究表明，Hp 2-2 Hb 复合物的清除效率也低于非 Hp 2-2 Hb 复合物。 在 DM2 患者中，由于 CD163 的下调，这种现象更加明显，特别是在 Hp 2-2 个体中。 在 Hp 2-2 患者中也观察到通过 CD163/pAkt /IL-10 轴的抗炎巨噬细胞信号传导受损。

   Hp 2-2 DM2 个体中的 Hp-Hb 清除不足导致 Hp-Hb 与高密度脂蛋白 (HDL-C) 上 Apo A1 的结合增加，从而将促氧化血红素部分与 HDL 结合。 这使得它缺乏从巨噬细胞反向转移胆固醇的能力。

   与 Hp 1-1 相比，Hp 2-2 蛋白在阻断血红素从 Hb 转移方面的效率较低。 此外，Hb 糖基化时血红素转移增加可能为 Hp 2-2 DM2 中心血管疾病增加提供了机制解释。

   因此，Hp 2-2 表型与 Hb 结合能力下降、Hp 2-2 Hb 复合物清除率下降、抗炎信号通路受损、LDL 氧化增加、HDL-胆固醇在阻断血红素转移方面效率低下和效率低相关从 Hb 到 Hp 1-1 都会导致更高的心血管风险。 在其中一些途径也受到影响的糖尿病患者中，高血糖和触珠蛋白表型的协同作用加剧，导致更高的风险。

   在其他人群中进行的纵向研究中，已经发现 Hp 2-2 基因型与 DM 患者 CVD 事件风险增加 2-5 倍有关。 特别是强心脏研究，Hp 2-2 表型 DM 患 CVD 的比值比 Hp 2-1 表型 DM 高 2-5 倍 (p=0.002)。 在慕尼黑支架研究中，连续对 935 名接受治疗的糖尿病患者进行了为期一年的支架植入术后主要不良心脏事件随访。 在这项研究中，触珠蛋白 2-2 表型被认为是主要不良心脏事件的独立预测因子。 此外，已经发现维生素 E 为一组人群中的 Hp 2-2 DM 患者提供了显着的心血管益处（以色列-ICARE 研究）和 WHS（女性健康研究）和 HOPE 研究的事后分析，以了解维生素 E在触珠蛋白 2-2 表型影响死亡率的患者亚组中补充 E 显示总死亡率没有显着降低。 这还没有被广泛采用，因为需要在多个人群中进行更大规模的试验来证实相关性和益处。

   Hp 表型和种族

   在新加坡进行的一项本地研究中，已经看到Hp基因的频率在不同种族中存在如下差异：Chinese Hp1：0.330；Hp2：0.670；Hp0： 0.029；马来人：Hp1：0.298；Hp2：0.702 ;HP0:0.004; 印第安人 Hp1：0.167；Hp2：0.833；Hp0：0.009。 在我们的人群中，Hp 频率的分布已被视为处于 Hardy-Weinberg 平衡状态，因此 Hp 2-2 的预期患病率约为 30-40%。 Hp 表型将由 TTSH 研究实验室的 TaqMan 分析确定。

   1.2 触珠蛋白基因型与内皮功能

   内皮功能障碍作为 DM 血管疾病发病机制的潜在因素而受到越来越多的关注。 在 DM2 中，内皮释放收缩因子和舒张因子的自然微妙平衡被改变，这导致进一步的血管和终末器官损伤。 受损的内皮功能被假定提供了一个最终的共同途径，多种风险因素通过该途径对心血管健康产生有害影响，并且已被确定为心血管风险的有力替代标志物，一项研究显示比 Framingham 风险评分更好的可预测性。 将使用 EndoPAT 2000 设备，因为它已被确定用于以非侵入性方式估计内皮功能。

   没有直接研究 Hp 基因型与内皮功能的关联，在一项初步研究中，使用缺血后反应性充血和应变计体积描记法评估内皮功能，并表示为缺血期后的最大流量，发现与非 Hp 2-2 患者相比，Hp 2-2 糖尿病患者的内皮功能更差（450 +-50 对 600+-40）。

   1.3 触珠蛋白基因型和 CIMT（颈动脉内膜中层厚度）

   在糖尿病心脏研究中，Hp 基因型的遗传分析显示 Hp 2-2 基因型与颈动脉内膜中层厚度 (CIMT) 之间存在关联。 根据曼海姆 CIMT 共识的建议，这些测量将在受试者躺下时进行，头部伸展并略微转向与检查的颈动脉相反的方向。两名研究人员估计了 23 个人的 CIMT，并绘制了 Bland-Altman 图并且发现用户间一致性的限制在 -0.1 到 +0.1 之间。

   1.4 结合珠蛋白基因型和主动脉僵硬度

   尽管没有比较 Hp 基因型和主动脉硬度的直接研究，但进行了一项研究，其中他们使用脉搏波轮廓分析方法评估了大动脉和小动脉的动脉弹性。 与 Hp 1-1 相比，Hp 2-2 患者的大动脉弹性指数较低（8.4 +-2.3 ml/mmHg 对 12.6 +-4.1 ml/mmHg x 100；p

   在 2 型糖尿病的早期使用 sphygmocor 装置已经观察到血管硬度增加。 这种僵硬很可能与内皮功能障碍有关，而不是与结构性血管改变有关——这反过来表明它是可逆的。 主动脉脉搏波速度 (PWV) 是主动脉扩张性的一种衡量指标，也被认为可以独立于已知的混杂因素预测糖尿病患者的死亡率。 将使用 SphygmoCor Xcel 设备，使用颈动脉到股动脉的脉搏波速度和中心主动脉压力来估计主动脉硬度。 研究人员将估计 20 个人的脉搏波速度，以便在开始研究之前使用 Bland-Altman 图确定一致限度。

   1.5 触珠蛋白基因型和血管标志物

   血管细胞粘附分子-1 (VCAM-1) 和细胞间粘附分子-1 (ICAM-1) 是在活化的内皮细胞 (EC) 表面表达并在早期动脉粥样硬化中表达的蛋白质。 这些标志物已被评估并被认为是内皮功能障碍的良好标志物，因为部分蛋白质在循环中脱落并且可以在外周血浆中检测到。

   1.6 结合珠蛋白基因型和血脂表型

   Hp 2-2 表型与较高的氧化 LDL 浓度有关，这主要与动脉粥样硬化有关。 Apo-A1 HDL 的浓度也已知在这组患者中较高。 Hp 2-2 表型也可能与较高的 Lp(a) 浓度相关，使这些患者处于较高的心血管风险中。 将使用蛋白质组学对血浆脂质进行详细的表型分析以寻找新的关联。

   1.7 结合珠蛋白基因型和氧化应激

   已知 Hp 2-2 基因型赋予内皮更高的氧化应激。 总氧化电位将计算为氧化指数。 将进行如下两个测试来计算该指数。 该指数已被确定为对整体氧化应激的良好估计。

   1. d-ROMs 测试：该测试将使用自动 d-ROMs 方法对血清样本进行。 (Vassalle C, Pratali L, Boni C, Mercuri A, Ndreu R. 氧化应激评分作为冠状动脉疾病患者促氧化和抗氧化对应物的综合测量。 临床生物化学 2008;41:1162-7)
   2. FRAP（血浆铁还原能力 - 衡量血浆防止血管损伤的能力）和 d-ROM（活性氧代谢物的衍生物）测试将用于计算氧化应激评分。

   还将测量其他氧化应激标志物，例如乙二醛、甲基乙二醛、不对称二甲基精氨酸和高精氨酸。

   1.8 结合珠蛋白基因型和视网膜动静脉指数

   视网膜微血管异常的存在，尤其是动脉收缩和静脉扩张，与心血管风险增加有关，并与内皮功能障碍和炎症有关。目前还没有研究 Hp 基因型与视网膜动静脉 (AV) 指数之间的关系。 . 在检查之前，将滴入眼药水以扩大瞳孔以进行眼底检查并润滑角膜。 将在眼科诊所对受试者进行视网膜成像。 如果患者不想参加视网膜成像，他们可以选择退出视网膜成像测试。

   2.0 维生素 E、触珠蛋白表型和降低心血管风险

   虽然 Hp1 和 Hp2 等位基因蛋白产物之间的功能差异，特别是在 DM 中，可以解释 Hp 2-2 个体与非 Hp 2-2 个体对并发症易感性的差异，但维生素 E 的独特益处的主要原因是氧化还原活性 Hb仅在 Hp 2-2 DM 个体中与 HDL 相关。 在 DM 患者中，Hp-Hb 复合物减少导致 Hp-Hb 与高密度脂蛋白 (HDL) 上的 Apo-A1 结合增加，从而将促氧化血红素部分与 HDL 结合。 Hp 2-2 DM 个体中的 HDL 缺乏刺激胆固醇从巨噬细胞反向转移的能力。 除此之外，Hp 表型 2-2 与自由基清除不足和低密度脂蛋白过氧化作用增加导致的氧化应激增加有关。

   维生素 E 是一种有效的抗氧化剂，具有抗炎特性。 它通过其强大的自由基清除特性以及通过与抗氧化酶直接和强烈的相互作用显着缓解氧化应激的状况。 在人类和动物模型中补充维生素 E 已显示可减少脂质过氧化作用、超氧化物的产生并减少清道夫受体（SR-A 和 CD36）的表达，这些受体在泡沫细胞的形成中尤为重要。 尽管维生素 E 尚未被证明可用于降低一般人群的心血管风险，但它对具有 Hp 2-2 表型的 DM 患者有用，在一个人群中进行的研究中，这两种情况都会显着增加氧化应激。

   只有三项干预性随机对照试验 (RCT)，其中 DM 参与者接受的唯一抗氧化剂是维生素 E，并且确定了研究参与者的 Hp 类型。 ICARE 研究是唯一一项旨在评估 DM 患者维生素 E 的随机对照试验，其前瞻性收集了 Hp 基因型。 在这项研究中，1,434 名年龄 > 或 = 55 岁且具有 Hp 2-2 表型的 DM 个体被随机分配到维生素 E（400 IU/天/安慰剂）组。 与安慰剂组 (4.7%, p=0.001) 相比，接受维生素 E 组的个体在试验开始后 18 个月终止时的主要综合结局显着降低 (2.2%)。 此外，还分析了为 WHS 和 HOPE 研究招募的一部分患者的血液样本的 Hp 多态性，并根据患者的 Hp 类型重新评估结果。 在所有这些研究中，在 Hp 2-2 个体中发现心血管事件的风险更高，并且在该组中观察到补充维生素 E 的益处。

   2.1 维生素 E（α-生育酚）的剂量和持续时间的理由。

   我们将使用每天 400 IU 的维生素 E 和匹配的安慰剂。 我们将委托 Beacons 公司准备维生素 E 胶囊（400 IU）和配套的安慰剂胶囊。 维生素 E 制剂是存在于 RRR 构型中的天然生育酚。 我们将给予维生素 E 400 IU，持续 6 个月，因为大多数使用心血管风险替代指标的研究在补充后 6 个月内有所改善。 此外，在上述 ICARE 研究中，在 18 个月时观察到心血管结果的改善，因此表明 6 个月的持续时间应该足以观察到心血管风险替代标志物的改善。

   八种形式的维生素 E 分为两组；四种是生育酚，四种是生育三烯酚。 它们由前缀 alpha- (α-)、beta- (β-)、gamma- (γ-) 和 delta- (δ-) 标识。 α-生育酚是自然界中最丰富的形式，根据胎儿选择分析已知具有最高的生物活性，可逆转人类维生素 E 缺乏症状。 天然生育酚仅存在于 RRR 构型中。 合成形式包含八种不同的立体异构体，称为“全消旋”-α-生育酚。

   维生素 E 以天然形式存在于植物油（小麦胚芽油、向日葵油、红花油、玉米油和大豆油）、坚果（杏仁、花生和榛子）、种子（葵花籽）、绿叶蔬菜（菠菜和西兰花）和强化植物油中早餐麦片、果汁、人造黄油和涂抹酱。 医学研究所推荐的个人摄入量约为 15 毫克/天。 成人维生素 E 补充剂的最高安全水平是天然形式的维生素 E 为 1,500 IU/天，人造（合成）形式的维生素 E 为 1,000 IU/天。 流行的维生素 E 补充剂包括从天然油中提取的 D-α 生育酚。 市售的维生素 E 补充剂通常仅包含未酯化或以醋酸酯、琥珀酸酯或烟酸酯形式提供的 α-生育酚。 在人体中，游离和酯化的 α-生育酚具有相同的生物利用度。 补充剂可以包含天然 RRR 或合成（全外消旋）α-生育酚。 天然 RRR α-生育酚的生物活性高于合成的全消旋α-生育酚和其他天然形式的维生素 E。

   氧化应激和个体基因构成都有助于人类维生素 E 的稳态，这可能是临床试验中临床变量改善中出现的不同临床效果的原因。 维生素E在肠道被吸收，通过淋巴系统进入循环，与脂质一起被吸收，被包装成乳糜微粒并输送到肝脏。 通过肝脏后，只有 α-生育酚优先出现在血浆中，而大多数其他形式的维生素 E 优先被代谢，或者分泌到胆汁中，或者不被吸收并随粪便排出。 在肝脏中，肝脏 α-生育酚转移蛋白 (α-TTP) 特异性地分选出具有 2R-立体异构体的 α-形式。 血浆 RRR-α-生育酚掺入是一个可饱和过程。 尽管每天增加高达 1,320 毫克全消旋-α-生育酚的维生素 E 补充剂量，但 RRR-α-生育酚的血浆水平在大约 80 μM 时停止增加。 这可能继发于用新吸收的 α-生育酚快速替代循环，动力学分析表明整个 α-生育酚库每天都被替代。 在人类中，α-生育酚在体内的优先积累取决于功能性 α-TTP 和非α-生育酚代谢和排泄的增加。 α-生育酚转移蛋白通过控制肝脏中维生素 E 的分泌来调节维生素 E 的全身分布和浓度。 已经发现，氧化应激和缺氧、核受体 PPARα 和 RXR 的激动剂以及增加 cAMP 水平可诱导 α-生育酚转移蛋白基因的表达。 这是由一种已经存在的称为 cAMP 反应元件结合 (CREB) 转录因子的转录因子介导的。 健康人群中常见的单核苷酸多态性会极大地影响启动子活性。

   临床试验中使用了从 400 IU 到 2,000 IU 不等的各种剂量的维生素 E。 美国医学研究所建议的推荐膳食摄入量 (RDA) 为 15-1,000 毫克/天（1 毫克 = 1.5 IU；22.5-1,500 IU/天）。 我们使用 400 IU 的剂量，为期六个月。 没有证据表明在 RDA 内服用会产生不良反应，但是大剂量服用可能会出现出血毒性，尤其是在服用抗凝血剂的患者中。 因此，我们将排除使用抗凝剂的患者。

   3.0 统计考虑

   3.1 样本量计算：研究的总体估计样本量为 300 名患者。 RCT 阶段每个 Hp 表型层所需的 100 个样本量基于：5% I 类错误； 90% 电量；假设维生素 E 预计对每个风险标记物至少有中等影响，以 0.5 的标准化影响大小（平均差/合并标准误差）表示；具有相等方差的两个样本 t 检验；和 15% 的辍学率。 假设我们人群中 Hp 2-2 的流行率为 35%，我们需要筛选 300 名患者以招募 100 名 Hp 2-2 表型患者。

   假设 RHI 的平均差异为 0.25 个单位，相应的标准偏差 (SD) 为 0.3 - 产生的标准化效应大小为 0.25/0.3 = 0.83 作为在另一项研究中看到的 RHI 的最小差异。 由于 RCT 的试点性质以及研究的一般探索性质，我们没有针对多项测试/比较进行调整。

   体外研究的样本量受到有限资源的限制。 尽管如此，基于双侧 Wilcoxon 符号排序检验、5% I 类错误、0.5 对之间的相关性以及 5000 个蒙特卡洛模拟样本的模拟结果表明，20 对提供了足够的能力来检测中到大的标准化效应大小(M1)。

   随机化将通过网络以电子方式进行——一个受密码保护的集中式内联网网站，以确保患者在符合试验资格时被随机化（严格顺序）。 基于 1:1 分配比率的研究将采用分块随机化时间表，每块 10 个。 然后，受密码保护的专用站点将分配一个唯一的患者试验编号，该编号将与药物盒中标记的治疗编号相对应。 随机化后，第一剂将给予患者。

   3.2 数据处理和统计分析：数据处理在每次访问和电话跟进评估时，将使用设计良好的适当研究数据收集表收集所有相关信息。 所有研究数据将存储在研究数据库中，仅供数据输入和数据验证研究人员访问。

   统计分析计划 关于基线人口统计学和临床​​变量以及风险标记的数据将按 Hp 表型和整体进行总结，以提供对潜在关联的洞察力。 二进制数据将使用频率和比例进行汇总。 卡方检验和 Fisher 精确检验将用于评估相关关联（包括维生素 E 的益处），如有必要，逻辑回归将用于表征关联，同时针对潜在混杂因素进行调整。 连续变量将使用认为合适的平均值（标准偏差）或中值（范围）进行总结。 两个样本 t 检验或 Mann-Whitney 检验将用于评估相关关联，广义线性模型将用于表征关联，同时调整潜在的混杂因素。 考虑广义线性模型，因为它们可以在必要时容纳非正态（不对称）数据或对数正态数据（例如实验室数据）。 将为每个相关结果执行单独的测试和模型。

   来自体外研究的数据将按 Hp 2-2 表型状态和维生素 E 浓度按与上一段中所述类似的方式进行总结。 Wilcoxon Signed-Ranked 检验将用于按浓度评估维生素 E 在 Hp 表型组之间的益处。 Mann-Whitney 和 Jonckheere-Terpstra 检验将用于通过 Hp 表型组评估维生素 E 的浓度-效益关系。 将采用广义线性混合模型来探索各种趋势和关联，同时考虑 (i) Hp 2-2 和非 Hp 2-2 患者的匹配，(ii) 通过维生素 E 浓度对患者进行重复评估，(iii)针对潜在的混杂因素进行调整，以及 (iv) 通过使用其他适当的分布（例如对数正态分布或伽玛分布）针对数据的潜在非正态性（不对称性）进行调整。 将对体外研究的数据进行全面分析。

   Bland-Altman 分析将用于估计和评估协议和可靠性研究的协议限制。 在适当的情况下，将使用混合模型方法来估计和评估相关的可靠性系数。

   5.0 临床意义

   如果发现 Hp 2-2 表型与心血管风险之间存在关联，则可以针对这组患者在他汀类药物和其他常规治疗的基础上进行维生素 E 治疗，以降低心血管风险。 未来可以计划在全国范围内进行大规模随机对照试验，以了解维生素 E 治疗是否有助于降低这组患者的风险。 在多种族人群中进行此类研究势在必行，因为它可以深入了解预期收益的一致性和普遍性。