Haptoglobin-fenotypens samband med kärlfunktion och svar på vitamin E-tillskott hos patienter med diabetes mellitus typ 2: EVAS-försöket (EVAS)

1.0 Bakgrund och klinisk betydelse 1.1 Inledning Incidensen av diabetes mellitus typ 2 (DM2) växer snabbt globalt och i Singapore. Den främsta orsaken till ökad sjuklighet och mortalitet hos patienter med DM2 är utvecklingen av mikrovaskulära och makrovaskulära komplikationer. Även om strikt glykemisk kontroll har visat sig minska mikrovaskulära komplikationer, saknas bevis fortfarande när det gäller makrovaskulära komplikationer. Accelererad ateroskleros är den främsta orsaken till ökad dödlighet och sjuklighet hos dessa patienter. Det är av största vikt att utvärdera nya mål för att kontrollera ateroskleros hos patienter med DM2 utöver konventionell behandling. Det finns ett ouppfyllt behov av att hitta nya mål eller markörer som förutsäger ökad risk hos patienter med diabetes mellitus och vi måste överväga alternativa behandlingar utöver konventionella mål för att minska risken hos dessa högriskgruppspatienter.

Patienter med DM2 löper inte bara en ökad risk för åderförkalkning, de bär också en större del av sjukdomsbördan. Endotelial dysfunktion anses vara kännetecknet för den patologiska förolämpningen som tillfogas blodkärlen. Hyperglykemi påverkar mitokondriella, enzymatiska och icke-enzymatiska vägar associerade med generering av reaktiva syrearter (ROS), vilket leder till minskad kväveoxidbiotillgänglighet och endotelial dysfunktion, vanligen påvisad av minskad endotelberoende vasodilatation och ökade plasmanivåer av endotelhärledda regulatoriska proteiner. Dessutom har DM2-patienter äventyrat antioxidantförsvaret i form av låga nivåer av antioxidantenzymer och alfa-tokoferol (vitamin E), vilket kan hindra en adekvat kompensation för ökningen av oxidativ stress. En annan roll för oxidativ stress för att mediera utvecklingen av ateroskleros har också visats i den oxidativa hypotesen. I denna modell är det mest framträdande målet för oxidativ modifiering LDL-molekylen. Oxiderat LDL känns inte igen av LDL-receptorn men tas lätt upp av CD36-receptorreceptomvägen i makrofager, vilket leder till avsevärd kolesterylesterackumulering och skumcellbildning. Oxiderat LDL är proinflammatoriskt, det orsakar hämning av endoteliellt NO-syntetas, främjar vasokonstriktion och monocytadhesion och främjar trombocytaggregation och trombos.

Hp fenotyp och oxidativ vävnadsskada

Proteinet haptoglobin (Hp) är en antioxidant på grund av dess förmåga att neutralisera den oxidativa aktiviteten av hemoglobin (Hb). Hos människor kännetecknas Hp av en genetisk polymorfism med tre strukturellt olika fenotyper (Hp1-1, Hp 2-1 och Hp 2-2 som är resultatet av uttryck av två olika alleler (Hp 1 och Hp 2) av haptoglobingenen lokaliserade på kromosom 16q22. Proteinprodukten från Hp2-allelen är en sämre antioxidant jämfört med Hp1-allelprodukten. Hp 1-1 är en liten molekyl (86 kDa) med väldefinierad struktur, medan Hp 2-1 kännetecknas av heteropolymerer (86-300 kDA) och Hp 2-2 bildar stora makromolekylära komplex (170-1 000 kDa).

Hp:s funktion är att binda fritt Hb som frigörs från röda blodkroppar, som frigörs i blodet under den naturliga omsättningen av röda blodkroppar. Fritt Hb kan orsaka avsevärd oxidativ vävnadsskada som ett resultat av dess hemjärn. Men närhelst Hb frisätts i cirkulationen binder det omedelbart till Hp med extremt hög affinitet för att bilda ett Hp-Hb-komplex. Denna bindning tjänar till att hämma den oxidativa potentialen hos Hb genom att förhindra frisättning av hemjärn från Hb. Hp finns normalt i blodet i ett mer än 400-faldigt molärt överskott till fritt Hb och därför kan Hp binda allt Hb som frigörs under normal omsättning av röda blodkroppar. När väl Hb är bundet till Hp rensas det snabbt från blodomloppet via CD163 scavenger-receptorn uttryckt på monocyter/makrofager, men bildning och clearance av Hp-Hb-komplex försämras i Hp 2-2-fenotyper.

Järn som härrör från Hb kan katalysera ett antal oxidativa reaktioner som kan hämmas av Hp.

1. Järnhaltigt hemjärn (Fe2+) kan reagera med väteperoxid för att ge järn-Hb (Fe3+) och den mycket reaktiva hydroxylradikalen. Genom att abstrahera en väteatom från fleromättade fettsyror kan hydroxylradikaler initiera processen med lipidperoxidation.
2. Järnhaltiga Hb (Fe2+) kan också reagera med väteperoxid för att producera ferryl Hb (Fe4+), en mycket instabil molekyl som lätt reagerar med en andra molekyl av väteperoxid för att ge järn-Hb (Fe3+) och superoxidanjon. De skadliga effekterna av superoxidanjon är tvåfaldiga: reduktion av ferrijärn (Fe3+) i Hb till ferrojärn (Fe2+), vilket möjliggör produktion av ytterligare hydroxylradikal som beskrivs i reaktion 1, och dismutation av superoxidanjon för att producera väteperoxid , återigen främja produktionen av ROS.

3. Järn-Hb (innehållande Fe3+), även känd som methemoglobin, kan spontant överföra sin hem-del, vilket resulterar i att hem kommer in i olika lipofila miljöer såsom LDL eller cellmembran. När det väl har interkalerats i sin nya lipidmiljö kan hemjärn genomgå reaktioner med väteperoxid enligt beskrivningen ovan eller med intilliggande lipidperoxider som genererar en fri radikalkaskad och leder till omfattande lipidoxidation.

   Som en del av Hp-Hb-komplexet stabiliserar Hp hem i hemfickan av Hb och förhindrar Hb från att orsaka oxidativ skada. Men i vilken grad Hp neutraliserar redoxaktiviteten hos hemjärn skiljer sig mellan Hp-typer. Detta har visats i ett antal system både in vitro och in vivo. Till exempel visade studier med linolensyra att Hp 1-1 förhindrade oxidation (dienbildning) mätt genom en ökning av absorbansen vid 232 nm i större utsträckning än Hp 2-2. En annan studie undersökte LDL-oxidation på grund av hemöverföring från Hb till LDL. Hemöverföring mättes genom släckning av fluorescenssignalen som emitterats av dansylerad LDL. Det visade sig att Hp 1-1 var överlägsen i att förhindra hemöverföring från Hb jämfört med Hp 2-2.

   Hp-fenotyper och kardiovaskulära riskstudier har visat att Hp 2-2 Hb-komplex också elimineras mindre effektivt än icke Hp 2-2 Hb-komplex. Hos DM2-patienter är detta fenomen mer uttalat på grund av nedregleringen av CD163, särskilt hos Hp 2-2-individer. En försämring av antiinflammatorisk makrofagsignalering genom en CD163/pAkt /IL-10-axel ses även hos Hp 2-2-patienter.

   Hp-Hb-brist clearance hos Hp 2-2 DM2-individer resulterar i ökad Hp-Hb-bindning till Apo A1 på högdensitetslipoprotein (HDL-C), vilket binder den prooxidativa hemdelen till HDL. Detta gör den bristfällig i sin förmåga att vända överföring av kolesterol från makrofager.

   Hp 2-2-proteinet är mindre effektivt för att blockera hemöverföring från Hb jämfört med Hp 1-1. Dessutom kan ökningen av hemöverföring när Hb glykosyleras ge en mekanistisk förklaring till ökningen av hjärt-kärlsjukdom som ses i Hp 2-2 DM2.

   Följaktligen är Hp 2-2-fenotyp associerad med minskad förmåga att binda till Hb, minskad clearance av Hp 2-2 Hb-komplex, försämring av antiinflammatorisk signalväg, ökad LDL-oxidation, gör HDL-kolesterol ineffektivt och mindre effektivt för att blockera hemöverföring från Hb till Hp 1-1 leder alla till en högre kardiovaskulär risk. Hos diabetespatienter där vissa av dessa vägar också påverkas förvärras den synergetiska effekten av hyperglykemi och haptoglobinfenotyp, vilket leder till högre risk.

   I longitudinella studier gjorda i andra populationer har man sett att Hp 2-2 genotyp är associerad med en 2-5 gånger ökad risk för incident CVD hos individer med DM. Speciellt i studien med starkt hjärta var oddskvoten för att ha hjärt-kärlsjukdom i DM med Hp 2-2-fenotypen 2-5 gånger högre än i DM med Hp 2-1-fenotyp (p=0,002). I Munich Stent-studien följdes en på varandra följande serie av 935 behandlade diabetiker upp i ett år efter stentning för allvarliga hjärthändelser. I denna studie ansågs haptoglobin 2-2-fenotypen vara en oberoende prediktor för allvarliga hjärthändelser. Dessutom har man sett att vitamin E ger betydande kardiovaskulära fördelar för Hp 2-2 DM-patienter i en population (Israel-ICARE STUDY) och post-hoc analys av WHS (Women Health Study) och HOPE-studien för att se om Vitamin E-tillskott i subgrupp av patienter med haptoglobin 2-2 fenotyp påverkad mortalitet visade en icke-signifikant minskning av total dödlighet. Detta har inte antagits allmänt eftersom större försök, och på flera populationer, behövs för att styrka sambandet och fördelarna.

   Hp fenotyp och etnicitet

   I en lokal studie gjord i Singapore har man sett att frekvensen av Hp-generna varierar i de olika etniciteterna enligt följande: kinesiska Hp1:0.330;Hp2:0.670;Hp0: 0,029; Malaysiska:Hp1:0,298;Hp2:0,702 ;Hp0:0,004; Indianer Hp1: 0,167;Hp2:0,833;Hp0:0,009. Fördelningen av Hp-frekvenserna har setts vara vid Hardy-Weinberg-jämvikt i vår befolkning, varför den förväntade prevalensen av Hp 2-2 är runt 30-40%. Hp-fenotyperna kommer att bestämmas genom TaqMan-analys vid TTSH Research Laboratory.

   1.2 Haptoglobin-genotyper och endotelfunktion

   Endotelial dysfunktion har fått ökad uppmärksamhet som en potentiell bidragsgivare till patogenes av vaskulär sjukdom vid DM. I DM2 förändras den naturliga känsliga balansen i frisättningen av sammandragande och avslappnande faktorer av endotelet, vilket bidrar till ytterligare vaskulära skador och ändorganskador. Nedsatt endotelfunktion har postulerats ge en slutlig gemensam väg genom vilken flera riskfaktorer utövar sina skadliga effekter på kardiovaskulär hälsa och har etablerats som en kraftfull surrogatmarkör för kardiovaskulär risk med en studie som visar ännu bättre förutsägbarhet än Framingham riskpoäng. EndoPAT 2000-enheten kommer att användas eftersom denna har fastställts för uppskattning av endotelfunktionen på ett icke-invasivt sätt.

   Det finns inga direkta studier gjorda på att titta på en association av Hp-genotyper till endotelfunktion, i en pilotstudie där endotelfunktionen utvärderades med post-ischemisk reaktiv hyperemi och strain gauge plethysmography och uttryckt som maximalt flöde efter en ischemisk period, sågs det att Hp 2-2 patienter med diabetes hade sämre endotelfunktion jämfört med icke Hp 2-2 patienter (450 +-50 mot 600 +-40).

   1.3 Haptoglobin-genotyper och CIMT (Carotid intima media thickness)

   I Diabetes Heart-studien visade genetiska analyser av Hp-genotyper ett samband mellan Hp 2-2 genotyp och carotis intima media thickness (CIMT). Dessa mätningar kommer att göras med försökspersonen liggande, med huvudet utsträckt och något vänt mot halspulsådern undersökt, enligt rekommendationerna från Mannheim CIMT konsensus. Två utredare har uppskattat CIMT i 23 individer och en Bland-Altman plot plottades. och gränserna för avtal mellan användare befanns ligga inom -0,1 till +0,1.

   1.4 Haptoglobin-genotyper och aortaartärstelhet

   Även om det inte finns några direkta studier som jämförde Hp-genotyper och aortaartärstyvhet, gjordes en studie där de utvärderade artärelasticiteten hos stora och små artärer med hjälp av pulsvågskonturanalysmetoden. Det stora artärelasticitetsindexet var lägre hos patienter med Hp 2-2 jämfört med Hp 1-1 (8,4 +-2,3 ml/mmHg mot 12,6 +-4,1 ml/mmHg x 100; p

   Ökad vaskulär stelhet har setts tidigt under diabetes mellitus typ 2 med sphygmocor-apparat. Det är troligt att denna stelhet är relaterad till endoteldysfunktion snarare än strukturella vaskulära förändringar - detta tyder i sin tur på att den är reversibel. Aortapulsvåghastighet (PWV), ett mått på aortadistenbilitet, har också setts förutsäga dödlighet hos patienter med diabetes oberoende av kända störande faktorer. SphygmoCor Xcel-enheten kommer att användas för att uppskatta aortaartärens styvhet med hjälp av carotis till femoral pulsvågshastighet och centrala aortatrycket. Utredarna kommer att uppskatta pulsvågshastigheten hos 20 individer för att fastställa gränserna för överensstämmelse med hjälp av Bland-Altman-diagrammet innan studien påbörjas.

   1.5 Haptoglobin-genotyper och vaskulära markörer

   Vaskulär celladhesionsmolekyl-1 (VCAM-1) och intercellulär adhesionsmolekyl-1 (ICAM-1) är proteiner som uttrycks på ytan av aktiverade endotelceller (ECs) och uttrycks i tidig ateroskleros. Dessa markörer har utvärderats och ansetts vara bra markörer för endoteldysfunktion eftersom en del av proteinet avges i cirkulationen och kan detekteras i perifer plasma.

   1.6 Haptoglobin-genotyper och fenotypning av plasmalipider

   Hp 2-2-fenotyp har associerats med högre oxiderad LDL-koncentration, som främst är involverad i åderförkalkning. Koncentrationerna av Apo-A1 HDL är också kända för att vara högre i denna grupp av patienter. Hp 2-2-fenotyp kan också vara associerad med högre Lp(a)-koncentrationer vilket gör att dessa patienter löper högre kardiovaskulär risk. Detaljerad fenotypning av plasmalipider med hjälp av proteomik för att leta efter nya associationer kommer att göras.

   1.7 Haptoglobin-genotyper och oxidativ stress

   Det är känt att Hp 2-2 genotyp ger en högre oxidativ stress på endotelet. Den totala oxidativa potentialen kommer att beräknas som Oxidativ-INDEX. Två tester kommer att göras enligt följande för att beräkna detta index. Detta index har fastställts som en bra uppskattning av den totala oxidativa stressen.

   1. d-ROM-test: Detta test kommer att utföras på serumprover med hjälp av den automatiska d-ROM-metoden. (Vassalle C, Pratali L, Boni C, Mercuri A, Ndreu R. En oxidativ stresspoäng som ett kombinerat mått på pro-oxidant och anti-oxidant motsvarigheter hos patienter med kranskärlssjukdom. Clin Biochem 2008;41:1162-7)
   2. FRAP (ferric reducing ability of plasma - ett mått på plasmans förmåga att förhindra skador på kärl) och d-ROMs (derivat för Reactive Oxygen Metabolites) test kommer att användas för att beräkna poängen för oxidativ stress.

   Andra markörer för oxidativ stress kommer också att mätas såsom glyoxal, metylglyoxal, asymmetrisk dimetylarginin och homoarginin.

   1.8 Haptoglobin-genotyper och retinalt arteriovenöst index

   Förekomsten av mikrovaskulära avvikelser i näthinnan, särskilt arteriell sammandragning och venulär dilatation, har associerats med en ökad kardiovaskulär risk och har associerats med endoteldysfunktion och inflammation. För närvarande finns det inga studier som tittar på sambandet mellan Hp-genotyper och retinalt arteriovenöst (AV)-index. . Inför undersökningarna kommer ögondroppar att instilleras för att vidga pupiller för ögonbottenundersökning och för att smörja in hornhinnan. Näthinneavbildning kommer att göras för försökspersonerna på ögonkliniken. Om patienter inte vill delta i näthinneavbildningen kan de välja att välja bort näthinneavbildningstestet.

   2.0 Vitamin E, haptoglobin fenotyp och kardiovaskulär riskminskning

   Även om funktionella skillnader mellan Hp1- och Hp2-allelproteinprodukter, särskilt vid DM kan förklara skillnaderna i känslighet för komplikationer hos Hp 2-2-individer från icke Hp 2-2-individer, är den främsta orsaken till unik nytta av vitamin E att redoxaktivt Hb är associerat med HDL endast hos Hp 2-2 DM-individer. Hos patienter med DM resulterar minskade Hp-Hb-komplex i ökad Hp-Hb-bindning till Apo-A1 på högdensitetslipoprotein (HDL), vilket binder den prooxidativa hem-delen till HDL. HDL hos Hp 2-2 DM-individer är bristfällig i sin förmåga att stimulera omvänd överföring av kolesterol från makrofager. Förutom dessa är Hp-fenotypen 2-2 associerad med ökad oxidativ stress på grund av bristfällig eliminering av fria radikaler och ökad LDL-peroxidation.

   Vitamin E är en potent antioxidant med antiinflammatoriska egenskaper. Det lindrar avsevärt tillståndet av oxidativ stress genom både dess kraftfulla fria radikalfångande egenskaper och genom att interagera direkt och starkt med antioxidantenzymerna. Vitamin E-tillskott i människor och djurmodeller har visat sig minska lipidperoxidation, superoxidproduktion och minska uttrycket av scavenger-receptorer (SR-A och CD36) som är särskilt viktiga vid bildandet av skumceller. Även om vitamin E inte har visat sig vara användbart för att minska kardiovaskulär risk i den allmänna befolkningen, har det varit användbart hos patienter med Hp 2-2 fenotyp med DM, båda tillstånd som ökar oxidativ stress avsevärt i studier gjorda i en population.

   Det har bara gjorts tre interventionella randomiserade kontrollerade studier (RCT) där den enda antioxidant som DM-deltagarna fick var vitamin E och där Hp-typ av studiedeltagare bestämdes. ICARE-studien var den enda RCT som syftade till att utvärdera vitamin E i DM-patienter för vilka Hp-genotypen prospektivt samlades in. I denna studie randomiserades 1 434 DM-individer > eller = 55 år med Hp 2-2-fenotypen till vitamin E (400 IE/dag/placebo). Det primära sammansatta resultatet reducerades signifikant hos individer som fick vitamin E (2,2 %) jämfört med placebo (4,7 %, p=0,001) 18 månader efter att prövningen inletts när den avslutades. Dessutom analyserades blodprover från en undergrupp av patienter som rekryterats för WHS- och HOPE-studierna för Hp-polymorfism, och resultaten omvärderades enligt patientens Hp-typ. I alla dessa studier sågs en högre risk för kardiovaskulära händelser hos Hp 2-2-individer och en fördel med E-vitamintillskott sågs i denna grupp.

   2.1 Motivering för dos och varaktighet av vitamin E (alfa-tokoferol).

   Vi kommer att använda vitamin E 400 IE per dag och matchad placebo. Vi kommer att beställa företaget Beacons som kommer att förbereda vitamin E-kapslarna (400 IE) och de matchande placebokapslarna. Vitamin E-preparat kommer att vara den naturliga tokoferolen som förekommer i RRR-konfigurationen. Vi kommer att ge vitamin E 400 IE i 6 månader eftersom de flesta studier med surrogatmarkörer för kardiovaskulär risk har sett en förbättring inom 6 månader efter tillskott. I ICARE-studien som nämnts ovan sågs dessutom en förbättring av kardiovaskulärt resultat efter 18 månader, vilket tyder på att 6 månader borde vara tillräckligt lång för att se en förbättring av surrogatmarkörer för kardiovaskulär risk.

   De åtta formerna av vitamin E är indelade i två grupper; fyra är tokoferoler och fyra är tokotrienoler. De identifieras med prefixen alfa- (α-), beta- (β-), gamma- (γ-) och delta- (δ-). alfa-tokoferol är den vanligaste formen i naturen, känd för att ha den högsta biologiska aktiviteten baserat på fetala resortion-analyser och vänder på vitamin E-bristsymptom hos människor. Naturliga tokoferoler förekommer endast i RRR-konfigurationen. Den syntetiska formen innehåller åtta olika stereoisomerer och kallas 'all-rac'-α-tokoferol.

   Vitamin E finns i sin naturliga form i vegetabiliska oljor (vetegrodds-, solros-, safflor-, majs- och sojabönolja), nötter (mandlar, jordnötter och hasselnötter), frön (solrosfrön), gröna bladgrönsaker (spenat och broccoli) och berikade frukostflingor, fruktjuicer, margarin och pålägg. Institutet för medicin rekommenderade intag för individer är cirka 15 mg/dag. Den högsta säkra nivån av vitamin E-tillskott för vuxna är 1 500 IE/dag för naturliga former av vitamin E och 1 000 IE/dag för den konstgjorda (syntetiska) formen. Populära vitamin E-tillskott som finns tillgängliga inkluderar D-alfa-tokoferol som härrör från naturliga oljor. Kommersiellt tillgängliga vitamin E-tillskott innehåller vanligtvis endast alfa-tokoferol tillhandahållet antingen ofestrat eller som ester av acetat, succinat eller nikotinat. Hos människor har fri och förestrad alfa-tokoferol samma biotillgänglighet. Kosttillskott kan innehålla antingen den naturliga RRR- eller syntetisk (all-rac) alfa-tokoferol. Den biologiska aktiviteten av naturligt RRR alfa-tokoferol är högre än för syntetiskt all-rac-alfa-tokoferol och andra naturliga former av vitamin E.

   Både oxidativ stress och individuell genetisk sammansättning bidrar till vitamin E homeostas hos människor och detta kan vara ansvarigt för de varierande kliniska effekterna som ses i förbättring av kliniska variabler i kliniska prövningar. Vitamin E absorberas i tarmen, kommer in i cirkulationen via lymfsystemet där det absorberas tillsammans med lipider, packas in i kylomikroner och transporteras till levern. Efter passage genom levern förekommer endast alfa-tokoferol i plasman och de flesta andra former av vitamin E metaboliseras företrädesvis och antingen utsöndras i gallan eller tas inte upp och utsöndras i feces. I levern sorterar hepatiskt alfa-tokoferolöverföringsprotein (α-TTP) specifikt ut α-formen med 2R-stereoisomererna. RRR-a-tokoferol i plasma är en mättbar process. Plasmanivåerna av RRR-α-tokoferol upphör att öka vid cirka 80 μM trots ökande doser av vitamin E-tillskott på upp till 1 320 mg all-rac-α-tokoferol per dag. Detta är sannolikt sekundärt till den snabba ersättningen av cirkulerande med nyligen absorberad α-tokoferol och kinetiska analyser visar att hela poolen av α-tokoferol ersätts dagligen. Hos människor är den föredragna ackumuleringen av α-tokoferol i kroppen beroende av både en funktionell α-TTP och ökad metabolism och utsöndring av icke-α-tokoferoler. Alfa-tokoferolöverföringsproteinet reglerar hela kroppens distribution och koncentrationer av vitamin E genom att kontrollera utsöndringen av vitamin E från levern. Man har sett att uttrycket av alfa-tokoferolöverföringsproteingenen kan induceras av oxidativ stress och hypoxi, av agonister av nukleära receptorer PPARa och RXR, och genom att öka cAMP-nivåer. Detta förmedlas av en redan närvarande transkriptionsfaktor som kallas cAMP-responselementbindande (CREB) transkriptionsfaktor. Enkelnukleotidpolymorfismer som vanligtvis finns hos friska människor påverkar drastiskt promotoraktiviteten.

   Olika doser av vitamin E från 400 IE till 2 000 IE har använts i kliniska prövningar. Institute of medicine, USA föreslår ett rekommenderat kostintag (RDA) på 15-1 000 mg/dag (1 mg = 1,5 IE; 22,5-1 500 IE/dag). Vi använder en dos på 400 IE under sex månader. Det finns inga bevis för biverkningar om det tas inom RDA, men det kan förekomma blödningstoxicitet i höga doser, särskilt hos patienter som tar antikoagulantia. Därför kommer vi att utesluta patienter på antikoagulantia.

   3.0 Statistiska överväganden

   3.1 Beräkning av provstorlek: Den totala uppskattade provstorleken för studien är 300 patienter. Den erforderliga provstorleken på 100 för varje Hp-fenotypskikt i RCT-fasen baseras på: 5 % typ I-fel; 90 % effekt; antagandet att vitamin E förväntas ha åtminstone en måttlig effekt, representerad av en standardiserad effektstorlek (medelskillnad/poolat standardfel) på 0,5, på varje riskmarkör; två prov t-test med lika varians; och en avhoppsfrekvens på 15 %. Om vi ​​antar 35 % förekomst av Hp 2-2 i vår befolkning, måste vi screena 300 patienter för att rekrytera 100 Hp 2-2 fenotyppatienter.

   Om man antar en medelskillnad på RHI på 0,25 enheter med motsvarande standardavvikelse (SD) på 0,3 - vilket ger en standardiserad effektstorlek på 0,25/0,3 = 0,83 som minimal skillnad i RHI sett i en annan studie. Vi justerade inte för flera tester/jämförelser på grund av RCT:s pilotkaraktär, såväl som studiens undersökande karaktär i allmänhet.

   Provstorleken för in vitro-studien är begränsad av begränsade resurser. Icke desto mindre indikerar simuleringsresultat baserade på ett dubbelsidigt Wilcoxon Signed-Ranked-test, 5 % typ I-fel, en korrelation mellan par på 0,5 och 5000 Monte Carlo-simuleringsprover att 20 par ger tillräcklig kraft för att detektera måttliga till stora standardiserade effektstorlekar (Ml).

   Randomisering kommer att göras elektroniskt via webben - en centraliserad lösenordsskyddad intranätwebbplats för att säkerställa att patienterna randomiseras i det ögonblick de är kvalificerade för prövningen (strikt sekventiell). Ett blockerat randomiseringsschema kommer att användas, i block om 10, för studien baserat på ett tilldelningsförhållande på 1:1. Den dedikerade lösenordsskyddade platsen kommer sedan att tilldela ett unikt patientprövningsnummer som motsvarar behandlingsnumren som är märkta i läkemedelslådorna. Efter randomisering kommer den första dosen att ges till patienten.

   3.2 Datahantering och statistiska analyser: Datahantering Allt relevant kommer att samlas in med hjälp av lämpliga väldesignade studiedatainsamlingsformulär vid varje besök och telefonuppföljningsbedömning. Alla studiedata kommer att lagras i en studiedatabas som endast kan bedömas för datainmatning och datavalideringsstudiepersonal.

   Statistisk analysplan Data om demografiska och kliniska baslinjevariabler samt riskmarkörer kommer att sammanfattas av Hp-fenotyper och övergripande för att ge insikt om potentiella samband. Binära data kommer att sammanfattas med hjälp av frekvens och proportioner. Chi-square-test och Fisher Exakt test kommer att användas för att utvärdera relevanta associationer (inklusive fördelarna med vitamin E), och vid behov kommer logistisk regression att användas för att karakterisera associationer samtidigt som man justerar för potentiella confounders. Kontinuerliga variabler kommer att sammanfattas med hjälp av medel (standardavvikelser) eller median (intervall) som bedöms lämpligt. Två prov t-test eller Mann-Whitney test kommer att användas för att utvärdera relevanta associationer och generaliserade linjära modeller kommer att användas för att karakterisera associationer samtidigt som man justerar för potentiella konfounders. Generaliserade linjära modeller övervägs eftersom de kan ta emot icke-normala (asymmetriska) data eller log-normala data (som laboratoriedata) vid behov. Separata tester och modeller kommer att utföras för varje relevant resultat.

   Data från in vitro-studien kommer att sammanfattas på liknande sätt som beskrivits i föregående stycke, genom Hp 2-2 fenotypstatus och vitamin E-koncentrationer. Wilcoxon Signed-Ranked test kommer att användas för att utvärdera fördelarna med vitamin E mellan Hp-fenotypgrupper efter koncentrationer. Mann-Whitney och Jonckheere-Terpstra test kommer att användas för att utvärdera förhållandet mellan koncentration och nytta av vitamin E av Hp-fenotypgrupper. Generaliserade linjära blandade modeller kommer att användas för att utforska olika trender och samband samtidigt som man tar hänsyn till (i) matchningen av Hp 2-2 och icke Hp 2-2 patienter, (ii) upprepad bedömning inom en patient genom vitamin E-koncentration, (iii) justering för potentiella konfounders, och (iv) justering för potentiell icke-normalitet (asymmetri) hos data genom att använda andra lämpliga distributioner såsom log-normal- eller gammafördelningar. En övergripande analys av data från in vitro-studier kommer att göras.

   Bland-Altman-analys kommer att användas för att uppskatta och utvärdera gränserna för överensstämmelse för överenskommelsen och tillförlitlighetsstudierna. Där så är lämpligt kommer en blandad modell att användas för att uppskatta och utvärdera de relevanta tillförlitlighetskoefficienterna.

   5.0 Klinisk betydelse

   Om ett samband ses mellan Hp 2-2 fenotyp med kardiovaskulär risk kan denna grupp patienter riktas mot E-vitaminbehandling utöver statiner och annan konventionell behandling för att minska kardiovaskulär risk. Framtida storskalig rikstäckande RCT kan planeras för att se om E-vitaminbehandling bidrar till att minska risken hos denna patientgrupp. Att genomföra sådana studier i en multietnisk befolkning är absolut nödvändigt eftersom det ger insikt om konsekvensen och generaliserbarheten av de förväntade fördelarna.