Relación del fenotipo de haptoglobina con la función vascular y la respuesta a la suplementación con vitamina E en pacientes con diabetes mellitus tipo 2: el ensayo EVAS (EVAS)

1.0 Antecedentes y significado clínico 1.1 Introducción La incidencia de Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2) está creciendo rápidamente a nivel mundial y en Singapur. La principal causa del aumento de la morbimortalidad en pacientes con DM2 es el desarrollo de complicaciones micro y macrovasculares. Aunque se ha demostrado que el control estricto de la glucemia reduce las complicaciones microvasculares, todavía falta evidencia con respecto a las complicaciones macrovasculares. La aterosclerosis acelerada es la principal causa de aumento de la mortalidad y la morbilidad en estos pacientes. Es de suma importancia evaluar nuevos objetivos para controlar la aterosclerosis en pacientes con DM2 además del tratamiento convencional. Existe una necesidad insatisfecha de encontrar nuevos objetivos o marcadores que predigan un mayor riesgo en pacientes con diabetes mellitus y debemos considerar tratamientos alternativos además de los objetivos convencionales para reducir el riesgo en este grupo de pacientes de alto riesgo.

Los pacientes con DM2 no solo tienen un mayor riesgo de aterosclerosis, sino que también soportan una mayor carga de la enfermedad. La disfunción endotelial se considera el sello distintivo del insulto patológico infligido a los vasos sanguíneos. La hiperglucemia afecta las vías mitocondriales, enzimáticas y no enzimáticas asociadas con la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS), lo que conduce a una disminución de la biodisponibilidad del óxido nítrico y disfunción endotelial, comúnmente demostrada por una reducción de la vasodilatación dependiente del endotelio y un aumento de los niveles plasmáticos de proteínas reguladoras derivadas del endotelio. Además, los pacientes con DM2 tienen comprometidas las defensas antioxidantes en forma de niveles bajos de enzimas antioxidantes y alfa-tocoferol (vitamina E), lo que puede impedir una adecuada compensación del aumento del estrés oxidativo. Otro papel del estrés oxidativo en la mediación del desarrollo de la aterosclerosis también se ha demostrado en la hipótesis oxidativa. En este modelo, el objetivo más destacado para la modificación oxidativa es la molécula de LDL. El LDL oxidado no es reconocido por el receptor de LDL, pero es absorbido fácilmente por la vía del receptor eliminador de CD36 en los macrófagos, lo que conduce a una acumulación apreciable de éster de colesterilo y formación de células espumosas. La LDL oxidada es proinflamatoria, causa inhibición de la NO sintetasa endotelial, promueve la vasoconstricción y la adhesión de monocitos, y promueve la agregación plaquetaria y la trombosis.

Fenotipo Hp y daño tisular oxidativo

La proteína haptoglobina (Hp) es un antioxidante debido a su capacidad para neutralizar la actividad oxidativa de la hemoglobina (Hb). En humanos, Hp se caracteriza por un polimorfismo genético con tres fenotipos estructuralmente diferentes (Hp1-1, Hp 2-1 y Hp 2-2) que resultan de la expresión de dos alelos diferentes (Hp 1 y Hp 2) del gen de la haptoglobina ubicado en cromosoma 16q22. El producto proteico del alelo Hp2 es un antioxidante inferior en comparación con el producto del alelo Hp1. Hp 1-1 es una molécula pequeña (86 kDa) de estructura bien definida, mientras que Hp 2-1 se caracteriza por heteropolímeros (86-300 kDa) y Hp 2-2 forma grandes complejos macromoleculares (170-1000 kDa).

La función de Hp es unirse a la Hb libre liberada de los glóbulos rojos, que se libera en la sangre durante la renovación natural de los glóbulos rojos. La Hb libre es capaz de causar un daño tisular oxidativo considerable como resultado de su hierro hemo. Sin embargo, cada vez que se libera Hb en la circulación, se une inmediatamente a Hp con una afinidad extremadamente alta para formar un complejo Hp-Hb. Esta unión sirve para inhibir el potencial oxidativo de la Hb al evitar la liberación de hierro hemo de la Hb. La Hp normalmente se encuentra en la sangre en un exceso molar de más de 400 veces respecto a la Hb libre y, por lo tanto, la Hp es capaz de unirse a toda la Hb que se libera durante el recambio normal de glóbulos rojos. Una vez que la Hb se une a la Hp, se elimina rápidamente del torrente sanguíneo a través del receptor eliminador de CD163 expresado en monocitos/macrófagos; sin embargo, la formación y la eliminación de los complejos Hp-Hb se ven afectadas en los fenotipos Hp 2-2.

El hierro derivado de la Hb puede catalizar una serie de reacciones oxidativas que pueden ser inhibidas por la Hp.

1. El hierro hemo ferroso (Fe2+) puede reaccionar con el peróxido de hidrógeno para producir Hb férrica (Fe3+) y las especies de radicales hidroxilo altamente reactivas. Al extraer un átomo de hidrógeno de los ácidos grasos poliinsaturados, los radicales hidroxilo pueden iniciar el proceso de peroxidación lipídica.
2. La Hb ferrosa (Fe2+) también puede reaccionar con peróxido de hidrógeno para producir Ferryl Hb (Fe4+), una molécula altamente inestable que reacciona fácilmente con una segunda molécula de peróxido de hidrógeno para producir Hb férrica (Fe3+) y anión superóxido. Los efectos dañinos del anión superóxido son dobles: reducción del hierro férrico (Fe3+) en Hb a hierro ferroso (Fe2+), lo que permite la producción de radicales hidroxilo adicionales como se describe en la reacción 1, y dismutación del anión superóxido para producir peróxido de hidrógeno. , nuevamente promoviendo la producción de ROS.

3. La Hb férrica (que contiene Fe3+), también conocida como metahemoglobina, puede transferir espontáneamente su fracción hemo, lo que da como resultado la entrada del hemo en diversos entornos lipofílicos, como las LDL o las membranas celulares. Una vez intercalado en su nuevo entorno lipídico, el hierro hemo puede sufrir reacciones con peróxido de hidrógeno como se describió anteriormente o con peróxidos lipídicos adyacentes generando una cascada de radicales libres y conduciendo a una oxidación extensa de lípidos.

   Como parte del complejo Hp-Hb, Hp estabiliza el hemo en el bolsillo de hemo de la Hb y evita que la Hb cause daño oxidativo. Sin embargo, el grado en que el Hp neutraliza la actividad redox del hierro hemo difiere entre los tipos de Hp. Esto se ha demostrado en varios sistemas tanto in vitro como in vivo. Por ejemplo, los estudios que utilizaron ácido linolénico mostraron que Hp 1-1 evitó la oxidación (formación de dieno) medida por un aumento en la absorbancia a 232 nm en mayor medida que Hp 2-2. Otro estudio examinó la oxidación de LDL debido a la transferencia de hemo de Hb a LDL. La transferencia de hemo se midió apagando la señal de fluorescencia emitida por LDL dansilada. Se encontró que Hp 1-1 era superior en la prevención de la transferencia de hemo desde Hb en comparación con Hp 2-2.

   Fenotipos Hp y estudios de riesgo cardiovascular han demostrado que los complejos Hp 2-2 Hb también se eliminan de manera menos eficiente que los complejos no Hp 2-2 Hb. En pacientes con DM2 este fenómeno es más pronunciado debido a la regulación a la baja de CD163, particularmente en individuos Hp 2-2. También se observa un deterioro en la señalización de macrófagos antiinflamatorios a través de un eje CD163/pAkt/IL-10 en pacientes con Hp 2-2.

   La eliminación deficiente de Hp-Hb en individuos Hp 2-2 DM2 da como resultado un aumento de la unión de Hp-Hb a Apo A1 en la lipoproteína de alta densidad (HDL-C), lo que une el resto hemo prooxidativo a HDL. Esto hace que sea deficiente en su capacidad para revertir la transferencia de colesterol de los macrófagos.

   La proteína Hp 2-2 es menos eficaz para bloquear la transferencia de hemo desde Hb en comparación con Hp 1-1. Además, el aumento de la transferencia de hemo cuando la Hb está glicosilada puede proporcionar una explicación mecánica del aumento de la enfermedad cardiovascular observado en Hp 2-2 DM2.

   Por lo tanto, el fenotipo Hp 2-2 se asocia con una menor capacidad para unirse a la Hb, una menor eliminación de los complejos Hp 2-2 Hb, una alteración en la vía de señalización antiinflamatoria, una mayor oxidación de LDL, hace que el colesterol HDL sea ineficaz y menos eficaz para bloquear la transferencia de hemo de Hb a Hp 1-1 todo lo cual conduce a un mayor riesgo cardiovascular. En los pacientes diabéticos en los que algunas de estas vías también se ven afectadas, el efecto sinérgico de la hiperglucemia y el fenotipo de haptoglobina se exacerba, lo que aumenta el riesgo.

   En estudios longitudinales realizados en otras poblaciones, se ha visto que el genotipo Hp 2-2 está asociado con un riesgo 2-5 veces mayor de incidencia de CVD en individuos con DM. En particular, en el estudio de corazón fuerte, la razón de posibilidades de tener ECV en DM con fenotipo Hp 2-2 fue de 2 a 5 veces mayor que en DM con fenotipo Hp 2-1 (p = 0,002). En el estudio Munich Stent, una serie consecutiva de 935 individuos diabéticos tratados fueron seguidos durante un año después de la colocación del stent por eventos cardíacos adversos importantes. En este estudio, se observó que el fenotipo de haptoglobina 2-2 era un predictor independiente de eventos cardíacos adversos importantes. Además, se ha visto que la vitamina E brinda un beneficio cardiovascular sustancial a pacientes con DM Hp 2-2 en una población (ESTUDIO ICARE-Israel) y análisis post-hoc del estudio WHS (Estudio de Salud de la Mujer) y HOPE para ver si la vitamina La suplementación con E en el subgrupo de pacientes con mortalidad influenciada por el fenotipo haptoglobina 2-2 mostró una reducción no significativa en la mortalidad total. Esto no ha sido ampliamente adoptado ya que se necesitan ensayos más grandes y en múltiples poblaciones para corroborar la asociación y los beneficios.

   Hp fenotipo y etnicidad

   En un estudio local realizado en Singapur, se ha visto que la frecuencia de los genes Hp varía en las diferentes etnias de la siguiente manera: chino Hp1:0.330;Hp2:0.670;Hp0: 0,029; Malayos:Hp1:0.298;Hp2:0.702 ;Hp0:0.004; Indios Hp1: 0.167;Hp2:0.833;Hp0:0.009. Se ha visto que la distribución de las frecuencias de Hp está en el equilibrio de Hardy-Weinberg en nuestra población, por lo que la prevalencia esperada de Hp 2-2 es de alrededor del 30-40%. Los fenotipos de Hp se determinarán mediante análisis TaqMan en el Laboratorio de Investigación TTSH.

   1.2 Genotipos de haptoglobina y función endotelial

   La disfunción endotelial ha recibido una atención creciente como posible contribuyente a la patogenia de la enfermedad vascular en la DM. En la DM2, se altera el delicado equilibrio natural en la liberación de factores de contracción y relajación por parte del endotelio, lo que contribuye a un mayor daño vascular y de órganos diana. Se ha postulado que la función endotelial deteriorada proporciona una vía común final por la cual múltiples factores de riesgo ejercen sus efectos nocivos sobre la salud cardiovascular y se ha establecido como un poderoso marcador sustituto del riesgo cardiovascular con un estudio que muestra una previsibilidad incluso mejor que la puntuación de riesgo de Framingham. Se utilizará el dispositivo EndoPAT 2000 ya que se ha establecido para la estimación de la función endotelial de forma no invasiva.

   No se han realizado estudios directos sobre la búsqueda de una asociación de los genotipos Hp con la función endotelial, en un estudio piloto en el que se evaluó la función endotelial mediante hiperemia reactiva posisquémica y pletismografía con medidor de tensión y se expresó como flujo máximo después de un período isquémico, se observó que los pacientes con diabetes Hp 2-2 tenían peor función endotelial en comparación con los pacientes sin Hp 2-2 (450 ± 50 versus 600 ± 40).

   1.3 Genotipos de haptoglobina y CIMT (Grosor de la íntima media carotídea)

   En el estudio Diabetes Heart, los análisis genéticos de los genotipos Hp mostraron una asociación entre el genotipo Hp 2-2 y el grosor de la íntima media carotídea (CIMT). Estas mediciones se realizarán con el sujeto acostado, con la cabeza extendida y ligeramente girada en sentido opuesto a la carótida examinada, siguiendo las recomendaciones del consenso CIMT de Mannheim. Dos investigadores han estimado el CIMT en 23 individuos y se trazó un gráfico de Bland-Altman. y se encontró que los límites del acuerdo entre usuarios estaban dentro de -0.1 a +0.1.

   1.4 Genotipos de haptoglobina y rigidez de la arteria aórtica

   Aunque no se han realizado estudios directos que comparen los genotipos de Hp y la rigidez de la arteria aórtica, se realizó un estudio en el que evaluaron la elasticidad arterial de las arterias grandes y pequeñas utilizando el método de análisis del contorno de la onda del pulso. El índice de elasticidad de las grandes arterias fue menor en pacientes con Hp 2-2 en comparación con Hp 1-1 (8,4 ± 2,3 ml/mmHg versus 12,6 ± 4,1 ml/mmHg x 100; p

   Se ha observado un aumento de la rigidez vascular en las primeras etapas del curso de la diabetes mellitus tipo 2 utilizando el dispositivo sphygmocor. Es probable que esta rigidez esté relacionada con la disfunción endotelial más que con alteraciones vasculares estructurales, lo que a su vez sugiere que es reversible. También se ha observado que la velocidad de la onda del pulso aórtico (PWV), una medida de la distensibilidad aórtica, predice la mortalidad en pacientes con diabetes independientemente de los factores de confusión conocidos. Se utilizará el dispositivo SphygmoCor Xcel para estimar la rigidez de la arteria aórtica utilizando la velocidad de onda del pulso carótido a femoral y la presión aórtica central. Los investigadores estimarán la velocidad de la onda del pulso en 20 individuos para establecer los límites de concordancia mediante el gráfico de Bland-Altman antes de iniciar el estudio.

   1.5 Genotipos de haptoglobina y marcadores vasculares

   La molécula de adhesión de células vasculares 1 (VCAM-1) y la molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1) son proteínas que se expresan en la superficie de las células endoteliales activadas (EC) y se expresan en la aterosclerosis temprana. Estos marcadores han sido evaluados y considerados buenos marcadores de disfunción endotelial porque parte de la proteína se elimina en la circulación y puede detectarse en el plasma periférico.

   1.6 Genotipos de haptoglobina y fenotipado de lípidos plasmáticos

   El fenotipo Hp 2-2 se ha asociado con concentraciones más altas de LDL oxidadas, lo que está implicado principalmente en la aterosclerosis. También se sabe que las concentraciones de Apo-A1 HDL son más altas en este grupo de pacientes. El fenotipo Hp 2-2 también puede estar asociado con concentraciones más altas de Lp(a) que ponen a estos pacientes en mayor riesgo cardiovascular. Se realizará un fenotipado detallado de los lípidos plasmáticos utilizando proteómica para buscar asociaciones novedosas.

   1.7 Genotipos de haptoglobina y estrés oxidativo

   Se sabe que el genotipo Hp 2-2 confiere un mayor estrés oxidativo al endotelio. El potencial oxidativo total se calculará como el ÍNDICE-Oxidativo. Se realizarán dos pruebas de la siguiente manera para calcular este índice. Este índice se ha establecido como una buena estimación del estrés oxidativo global.

   1. Prueba de d-ROM: esta prueba se realizará en muestras de suero mediante el método automatizado de d-ROM. (Vassalle C, Pratali L, Boni C, Mercuri A, Ndreu R. Una puntuación de estrés oxidativo como una medida combinada de las contrapartes prooxidantes y antioxidantes en pacientes con enfermedad de las arterias coronarias. Clin Biochem 2008;41:1162-7)
   2. Se utilizarán las pruebas FRAP (capacidad de reducción férrica del plasma, una medida de la capacidad del plasma para prevenir daños en los vasos) y d-ROM (derivados de los metabolitos reactivos del oxígeno) para calcular la puntuación del estrés oxidativo.

   También se medirán otros marcadores de estrés oxidativo como el glioxal, el metilglioxal, la dimetilarginina asimétrica y la homoarginina.

   1.8 Genotipos de haptoglobina e índice arteriovenoso retiniano

   La presencia de anomalías microvasculares de la retina, especialmente la constricción arterial y la dilatación venular, se ha asociado con un mayor riesgo cardiovascular y con disfunción e inflamación endoteliales. Actualmente no hay estudios que analicen la relación entre los genotipos Hp y el índice arteriovenoso (AV) de la retina. . Antes de las investigaciones, se instilarán gotas para los ojos para dilatar las pupilas para el examen del fondo de ojo y para lubricar la córnea. Se realizarán imágenes retinales para los sujetos en la clínica oftalmológica. Si los pacientes no desean participar en las imágenes de la retina, pueden optar por no participar en la prueba de imágenes de la retina.

   2.0 Vitamina E, fenotipo haptoglobina y reducción del riesgo cardiovascular

   Si bien las diferencias funcionales entre los productos de proteínas alélicas Hp1 y Hp2, particularmente en la DM, pueden explicar las diferencias en la susceptibilidad a las complicaciones en los individuos Hp 2-2 y los que no son Hp 2-2, la razón principal del beneficio único de la vitamina E es que la Hb redox activa se asocia con HDL solo en individuos Hp 2-2 DM. En pacientes con DM, la disminución de los complejos Hp-Hb da como resultado un aumento de la unión de Hp-Hb a Apo-A1 en la lipoproteína de alta densidad (HDL), lo que une la fracción hemo prooxidativa a la HDL. HDL en individuos Hp 2-2 DM es deficiente en su capacidad para estimular la transferencia inversa de colesterol desde los macrófagos. Además de estos, el fenotipo Hp 2-2 se asocia con un mayor estrés oxidativo debido a una deficiente eliminación de radicales libres y una mayor peroxidación de LDL.

   La vitamina E es un potente antioxidante con propiedades antiinflamatorias. Alivia significativamente la condición de estrés oxidativo tanto por sus potentes propiedades de eliminación de radicales libres como por su interacción directa y fuerte con las enzimas antioxidantes. Se ha demostrado que la suplementación con vitamina E en humanos y modelos animales disminuye la peroxidación de lípidos, la producción de superóxido y la disminución de la expresión de los receptores depuradores (SR-A y CD36), que son particularmente importantes en la formación de células espumosas. Aunque no se ha demostrado que la vitamina E sea útil para reducir el riesgo cardiovascular en la población general, sí lo ha sido en pacientes con fenotipo Hp 2-2 con DM, ambas condiciones que aumentan sustancialmente el estrés oxidativo en estudios realizados en una población.

   Ha habido sólo tres ensayos controlados aleatorios (ECA) de intervención en los que el único antioxidante que recibieron los participantes con DM fue la vitamina E y en los que se determinó el tipo de Hp de los participantes del estudio. El estudio ICARE fue el único ECA destinado a evaluar la vitamina E en pacientes con DM para los que se recogió prospectivamente el genotipo Hp. En este estudio, 1434 personas con DM ≥ 55 años de edad con el fenotipo Hp 2-2 fueron aleatorizadas para recibir vitamina E (400 UI/día/placebo). El resultado compuesto primario se redujo significativamente en los individuos que recibieron vitamina E (2,2 %) en comparación con el placebo (4,7 %, p = 0,001) a los 18 meses después del inicio del ensayo cuando finalizó. Además, se analizaron muestras de sangre de un subconjunto de pacientes reclutados para los estudios WHS y HOPE en busca de polimorfismo Hp y se reevaluaron los resultados según el tipo de Hp del paciente. En todos estos estudios, se observó un mayor riesgo de eventos cardiovasculares en individuos Hp 2-2 y se observó un beneficio de la suplementación con vitamina E en este grupo.

   2.1 Justificación de la dosis y duración de la vitamina E (alfa-tocoferol).

   Usaremos 400 UI de vitamina E por día y un placebo combinado. Encargaremos a la empresa Beacons que prepare las cápsulas de vitamina E (400 UI) y las correspondientes cápsulas de placebo. La preparación de vitamina E será el tocoferol natural que se presenta en la configuración RRR. Daremos 400 UI de vitamina E durante 6 meses, ya que la mayoría de los estudios que utilizan marcadores indirectos de riesgo cardiovascular han observado una mejora en 6 meses después de la suplementación. Además, en el estudio ICARE mencionado anteriormente, se observó una mejora en el resultado cardiovascular a los 18 meses, lo que sugiere que 6 meses deberían ser una duración adecuada para ver una mejora en los marcadores indirectos de riesgo cardiovascular.

   Las ocho formas de vitamina E se dividen en dos grupos; cuatro son tocoferoles y cuatro son tocotrienoles. Se identifican con los prefijos alfa- (α-), beta- (β-), gamma- (γ-) y delta- (δ-). el alfa-tocoferol es la forma más abundante en la naturaleza, se sabe que tiene la actividad biológica más alta según los ensayos de conversión fetal y revierte los síntomas de deficiencia de vitamina E en humanos. Los tocoferoles naturales se encuentran únicamente en la configuración RRR. La forma sintética contiene ocho estereoisómeros diferentes y se llama 'all-rac'-α-tocopherol.

   La vitamina E se encuentra en su forma natural en aceites vegetales (aceites de germen de trigo, girasol, cártamo, maíz y soja), frutos secos (almendras, cacahuetes y avellanas), semillas (semillas de girasol), verduras de hoja verde (espinacas y brócoli) y fortificadas cereales para el desayuno, jugos de frutas, margarina y pastas para untar. La ingesta recomendada por el instituto de medicina para las personas es de aproximadamente 15 mg/día. El nivel seguro más alto de suplementos de vitamina E para adultos es de 1500 UI/día para las formas naturales de vitamina E y de 1000 UI/día para la forma artificial (sintética). Los suplementos populares de vitamina E disponibles incluyen D-alfa tocoferol, que se deriva de aceites naturales. Los suplementos de vitamina E disponibles en el mercado normalmente contienen solo alfa-tocoferol sin esterificar o como éster de acetato, succinato o nicotinato. En humanos, el alfa-tocoferol libre y esterificado tiene la misma biodisponibilidad. Los suplementos pueden contener alfa-tocoferol RRR natural o sintético (all-rac). La actividad biológica del alfa-tocoferol RRR natural es mayor que la del todo-rac-alfa-tocoferol sintético y otras formas naturales de vitamina E.

   Tanto el estrés oxidativo como la composición genética individual contribuyen a la homeostasis de la vitamina E en humanos y esto puede ser responsable de los efectos clínicos variables observados en la mejora de las variables clínicas en los ensayos clínicos. La vitamina E se absorbe en el intestino, ingresa a la circulación a través del sistema linfático donde se absorbe junto con los lípidos, se empaqueta en quilomicrones y se transporta al hígado. Después de pasar por el hígado, solo el alfa-tocoferol aparece preferentemente en el plasma y la mayoría de las otras formas de vitamina E se metabolizan preferentemente y se secretan en la bilis o no se absorben ni se excretan en las heces. En el hígado, la proteína de transferencia de alfa-tocoferol hepático (α-TTP) clasifica específicamente la forma α con los estereoisómeros 2R. La incorporación plasmática de RRR-α-tocoferol es un proceso saturable. Los niveles plasmáticos de RRR-α-tocoferol dejan de aumentar a aproximadamente 80 μM a pesar de las dosis crecientes de suplementos de vitamina E de hasta 1320 mg de todo-rac-α-tocoferol por día. Esto es probablemente secundario al rápido reemplazo de la circulación con α-tocoferol recién absorbido y los análisis cinéticos demuestran que la reserva completa de α-tocoferol se reemplaza diariamente. En los seres humanos, la acumulación preferencial de α-tocoferol en el organismo depende tanto de una α-TTP funcional como de un mayor metabolismo y excreción de no-α-tocoferoles. La proteína de transferencia de alfa-tocoferol regula la distribución y las concentraciones de vitamina E en todo el cuerpo al controlar la secreción de vitamina E del hígado. Se ha visto que la expresión del gen de la proteína de transferencia del alfa-tocoferol puede ser inducida por estrés oxidativo e hipoxia, por agonistas del receptor nuclear PPARα y RXR, y por aumento de los niveles de AMPc. Esto está mediado por un factor de transcripción ya presente llamado factor de transcripción de unión al elemento de respuesta cAMP (CREB). Los polimorfismos de un solo nucleótido que se encuentran comúnmente en personas sanas afectan drásticamente la actividad del promotor.

   Se han utilizado varias dosis de vitamina E que van desde 400 UI a 2000 UI en ensayos clínicos. El instituto de medicina de EE. UU. sugiere una ingesta dietética recomendada (RDA) de 15 a 1000 mg/día (1 mg = 1,5 UI; 22,5 a 1500 UI/día). Estamos usando una dosis de 400 UI durante seis meses. No hay evidencia de efectos adversos si se toma dentro de la RDA. Sin embargo, puede haber toxicidad hemorrágica en dosis altas, especialmente en pacientes con anticoagulantes. Por lo tanto, excluiremos a los pacientes con anticoagulantes.

   3.0 Consideraciones estadísticas

   3.1 Cálculo del tamaño de la muestra: El tamaño de la muestra global estimado para el estudio es de 300 pacientes. El tamaño de muestra requerido de 100 para cada estrato de fenotipo Hp de la fase RCT se basa en: 5% de error tipo I; 90% de potencia; la suposición de que se espera que la vitamina E tenga al menos un efecto moderado, representado por un tamaño del efecto estandarizado (diferencia de medias/error estándar combinado) de 0,5, en cada marcador de riesgo; prueba t de dos muestras con igual varianza; y una tasa de abandono del 15%. Suponiendo una prevalencia del 35% de Hp 2-2 en nuestra población, necesitamos evaluar a 300 pacientes para reclutar 100 pacientes con fenotipo Hp 2-2.

   Suponiendo una diferencia media en el RHI de 0,25 unidades con la desviación estándar (DE) correspondiente de 0,3, lo que arroja un tamaño del efecto estandarizado de 0,25/0,3 = 0,83 como diferencia mínima en RHI observada en otro estudio. No ajustamos para pruebas/comparaciones múltiples debido a la naturaleza piloto del ECA, así como a la naturaleza exploratoria del estudio en general.

   El tamaño de la muestra para el estudio in vitro está limitado por recursos limitados. No obstante, los resultados de la simulación basados ​​en una prueba de Wilcoxon Signed-Ranked de dos caras, 5 % de error de tipo I, una correlación entre pares de 0,5 y 5000 muestras de simulación de Monte Carlo indican que 20 pares proporcionan la potencia adecuada para detectar tamaños de efecto estandarizados de moderados a grandes (M1).

   La aleatorización se realizará electrónicamente a través de la web, un sitio web de intranet centralizado protegido con contraseña para garantizar que los pacientes sean aleatorizados en el momento en que sean elegibles para el ensayo (estrictamente secuencial). Se empleará un programa de aleatorización por bloques, en bloques de 10, para el estudio basado en una proporción de asignación de 1:1. El sitio dedicado protegido por contraseña asignará un número de prueba de paciente único que corresponderá a los números de tratamiento etiquetados en las cajas de medicamentos. Tras la aleatorización, se administrará la primera dosis al paciente.

   3.2 Manejo de datos y análisis estadísticos: Manejo de datos Todo lo relevante se recopilará utilizando formularios de recopilación de datos de estudio bien diseñados y apropiados en cada visita y evaluación de seguimiento por teléfono. Todos los datos del estudio se almacenarán en una base de datos del estudio evaluable solo para el personal del estudio de entrada y validación de datos.

   Plan de análisis estadístico Los datos sobre las variables clínicas y demográficas iniciales, así como los marcadores de riesgo, se resumirán por fenotipos de Hp y en general para brindar información sobre las posibles asociaciones. Los datos binarios se resumirán usando frecuencia y proporciones. Se usarán la prueba de chi-cuadrado y la prueba exacta de Fisher para evaluar las asociaciones relevantes (incluidos los beneficios de la vitamina E) y, si es necesario, se usará la regresión logística para caracterizar las asociaciones mientras se ajustan los posibles factores de confusión. Las variables continuas se resumirán utilizando medias (desviaciones estándar) o medianas (rango) según se considere apropiado. Se usará la prueba t de dos muestras o la prueba de Mann-Whitney para evaluar las asociaciones relevantes y se usarán modelos lineales generalizados para caracterizar las asociaciones mientras se ajustan los posibles factores de confusión. Se consideran modelos lineales generalizados ya que pueden acomodar datos no normales (asimétricos) o datos logarítmicos normales (como datos de laboratorio) si es necesario. Se realizarán pruebas y modelos separados para cada resultado relevante.

   Los datos del estudio in vitro se resumirán de manera similar a como se describe en el párrafo anterior, por el estado del fenotipo Hp 2-2 y las concentraciones de vitamina E. Se utilizará la prueba de clasificación por signos de Wilcoxon para evaluar los beneficios de la vitamina E entre los grupos de fenotipo Hp por concentraciones. Se utilizará la prueba de Mann-Whitney y Jonckheere-Terpstra para evaluar la relación concentración-beneficio de la vitamina E por grupos de fenotipo Hp. Se emplearán modelos mixtos lineales generalizados para explorar diversas tendencias y asociaciones teniendo en cuenta (i) la coincidencia de pacientes Hp 2-2 y no Hp 2-2, (ii) la evaluación repetida dentro de un paciente por concentración de vitamina E, (iii) ajustando por posibles factores de confusión, y (iv) ajustando por posible no normalidad (asimetría) de los datos mediante el uso de otras distribuciones apropiadas, como distribuciones log-normal o gamma. Se realizará un análisis general de los datos del estudio in vitro.

   El análisis de Bland-Altman se utilizará para estimar y evaluar los límites de concordancia para los estudios de concordancia y confiabilidad. Cuando corresponda, se utilizará un enfoque de modelo mixto para estimar y evaluar los coeficientes de confiabilidad relevantes.

   5.0 Importancia clínica

   Si se observa una asociación entre el fenotipo Hp 2-2 y el riesgo cardiovascular, este grupo de pacientes puede ser objeto de tratamiento con vitamina E además de estatinas y otros tratamientos convencionales para reducir el riesgo cardiovascular. Se pueden planificar futuros ECA a gran escala a nivel nacional para ver si el tratamiento con vitamina E ayuda a reducir el riesgo en este grupo de pacientes. Es imperativo realizar tales estudios en una población multiétnica, ya que proporciona información sobre la coherencia y la generalización de los beneficios esperados.