Forholdet mellom Haptoglobin-fenotype og vaskulær funksjon og respons på vitamin E-tilskudd hos pasienter med diabetes mellitus type 2: EVAS-forsøket (EVAS)

1.0 Bakgrunn og klinisk betydning 1.1 Innledning Forekomsten av diabetes mellitus type 2 (DM2) vokser raskt globalt og i Singapore. Hovedårsaken til økt morbiditet og dødelighet hos pasienter med DM2 er utviklingen av mikrovaskulære og makrovaskulære komplikasjoner. Selv om streng glykemisk kontroll har vist seg å redusere mikrovaskulære komplikasjoner, mangler bevisene fortsatt med hensyn til makrovaskulære komplikasjoner. Akselerert aterosklerose er den viktigste årsaken til økt dødelighet og sykelighet hos disse pasientene. Det er av største betydning å vurdere nye mål for å kontrollere aterosklerose hos pasienter med DM2 i tillegg til konvensjonell behandling. Det er et udekket behov for å finne nye mål eller markører som forutsier økt risiko hos pasienter med diabetes mellitus, og vi må vurdere alternative behandlinger på toppen av konvensjonelle mål for å redusere risikoen hos disse pasientene i høyrisikogruppen.

Pasienter med DM2 har ikke bare økt risiko for åreforkalkning, de bærer også en større grad av sykdomsbyrden. Endotelial dysfunksjon regnes som kjennetegnet på den patologiske fornærmelsen som påføres blodårene. Hyperglykemi påvirker mitokondrielle, enzymatiske og ikke-enzymatiske veier assosiert med generering av reaktive oksygenarter (ROS), som fører til redusert nitrogenoksidbiotilgjengelighet og endotelial dysfunksjon, ofte demonstrert ved redusert endotelavhengig vasodilatasjon og økte plasmanivåer av endotelavledede regulatoriske proteiner. Dessuten har DM2-pasienter kompromittert antioksidantforsvaret i form av lave nivåer av antioksidantenzymer og alfa-tokoferol (vitamin E), noe som kan hindre en tilstrekkelig kompensasjon for økningen i oksidativt stress. En annen rolle av oksidativt stress i å formidle utviklingen av aterosklerose har også blitt demonstrert i den oksidative hypotesen. I denne modellen er det mest fremtredende målet for oksidativ modifikasjon LDL-molekylet. Oksidert LDL gjenkjennes ikke av LDL-reseptoren, men tas lett opp av CD36-oppfangerens reseptorvei i makrofager som fører til betydelig kolesterylesterakkumulering og skumcelledannelse. Oksidert LDL er proinflammatorisk, det forårsaker hemming av endotelial NO-syntetase, fremmer vasokonstriksjon og monocyttadhesjon, og fremmer blodplateaggregering og trombose.

Hp fenotype og oksidativ vevsskade

Haptoglobin (Hp)-proteinet er en antioksidant på grunn av dets evne til å nøytralisere den oksidative aktiviteten til hemoglobin (Hb). Hos mennesker er Hp karakterisert ved en genetisk polymorfisme med tre strukturelt forskjellige fenotyper (Hp1-1, Hp 2-1 og Hp 2-2 som er et resultat av ekspresjon av to forskjellige alleler (Hp 1 og Hp 2) av haptoglobingenet lokalisert på kromosom 16q22. Proteinproduktet til Hp2-allelen er en dårligere antioksidant sammenlignet med Hp1-allelproduktet. Hp 1-1 er et lite molekyl (86 kDa) med veldefinert struktur, mens Hp 2-1 er karakterisert av heteropolymerer (86-300 kDA) og Hp 2-2 danner store makromolekylære komplekser (170-1000 kDa).

Funksjonen til Hp er å binde fritt Hb frigjort fra røde blodlegemer, som frigjøres til blodet under naturlig omsetning av røde blodlegemer. Fri Hb er i stand til å forårsake betydelig oksidativ vevsskade som følge av hemjernet. Men når Hb frigjøres i sirkulasjonen, binder det seg umiddelbart til Hp med ekstremt høy affinitet for å danne et Hp-Hb-kompleks. Denne bindingen tjener til å hemme det oksidative potensialet til Hb ved å forhindre frigjøring av hemjern fra Hb. Hp finnes normalt i blodet i et mer enn 400 ganger molart overskudd til fri Hb, og derfor er Hp i stand til å binde all Hb som frigjøres under normal omsetning av røde blodlegemer. Så snart Hb er bundet til Hp, fjernes det raskt fra blodstrømmen via CD163 scavenger-reseptoren uttrykt på monocytter/makrofager, men dannelse og clearance av Hp-Hb-komplekser er svekket i Hp 2-2-fenotyper.

Jern avledet fra Hb kan katalysere en rekke oksidative reaksjoner som kan hemmes av Hp.

1. Jernholdig hemjern (Fe2+) kan reagere med hydrogenperoksid for å gi jernholdig Hb (Fe3+) og den svært reaktive hydroksylradikalarten. Ved å abstrahere et hydrogenatom fra flerumettede fettsyrer, kan hydroksylradikaler sette i gang prosessen med lipidperoksidasjon.
2. Jernholdig Hb (Fe2+) kan også reagere med hydrogenperoksid for å produsere ferryl Hb (Fe4+), et svært ustabilt molekyl som lett reagerer med et andre molekyl av hydrogenperoksid for å gi jernholdig Hb (Fe3+) og superoksidanion. De skadelige effektene av superoksidanion er todelt: reduksjon av jern (Fe3+) i Hb til jernholdig jern (Fe2+), noe som muliggjør produksjon av ytterligere hydroksylradikal som beskrevet i reaksjon 1, og dismutering av superoksidanion for å produsere hydrogenperoksid , igjen fremme produksjonen av ROS.

3. Ferri-Hb (som inneholder Fe3+), også kjent som methemoglobin, kan spontant overføre sin hem-del, noe som resulterer i hem-inntreden i forskjellige lipofile miljøer som LDL eller cellemembraner. Når det er interkalert i det nye lipidmiljøet, kan hemjern gjennomgå reaksjoner med hydrogenperoksid som beskrevet ovenfor eller med tilstøtende lipidperoksider som genererer en fri radikal-kaskade og fører til omfattende lipidoksidasjon.

   Som en del av Hp-Hb-komplekset stabiliserer Hp hem i hemelommen til Hb, og forhindrer Hb i å forårsake oksidativ skade. Imidlertid varierer graden i hvilken Hp nøytraliserer redoksaktiviteten til hemjern mellom Hp-typer. Dette er vist i en rekke systemer både in vitro og in vivo. For eksempel viste studier med linolensyre at Hp 1-1 forhindret oksidasjon (diendannelse) målt ved en økning i absorbans ved 232 nm i større grad enn Hp 2-2. En annen studie undersøkte LDL-oksidasjon på grunn av hemoverføring fra Hb til LDL. Heme-overføring ble målt ved quenching av fluorescenssignalet som sendes ut av dansylert LDL. Det ble funnet at Hp 1-1 var overlegen når det gjaldt å forhindre hemoverføring fra Hb sammenlignet med Hp 2-2.

   Hp-fenotyper og kardiovaskulære risikostudier har vist at Hp 2-2 Hb-komplekser også fjernes mindre effektivt enn ikke-Hp 2-2 Hb-komplekser. Hos DM2-pasienter er dette fenomenet mer uttalt på grunn av nedreguleringen av CD163, spesielt hos Hp 2-2-individer. En svekkelse av anti-inflammatorisk makrofagsignalering gjennom en CD163/pAkt /IL-10 akse sees også hos Hp 2-2 pasienter.

   Hp-Hb-mangelfull clearance hos Hp 2-2 DM2-individer resulterer i økt Hp-Hb-binding til Apo A1 på high-density lipoprotein (HDL-C), og binder derved den pro-oksidative hem-delen til HDL. Dette gjør den mangelfull i sin evne til å reversere overføring av kolesterol fra makrofager.

   Hp 2-2-proteinet er mindre effektivt til å blokkere hemoverføring fra Hb sammenlignet med Hp 1-1. Videre kan økningen i hemoverføring når Hb er glykosylert gi en mekanistisk forklaring på økningen i kardiovaskulær sykdom sett i Hp 2-2 DM2.

   Hp 2-2-fenotype er derfor assosiert med redusert evne til å binde seg til Hb, redusert clearance av Hp 2-2 Hb-komplekser, svekkelse av anti-inflammatorisk signalvei, økt LDL-oksidasjon, gjør HDL-kolesterol ineffektivt og mindre effektivt i blokkering av hemoverføring fra Hb til Hp 1-1 fører alle til høyere kardiovaskulær risiko. Hos diabetespasienter hvor noen av disse veiene også påvirkes, forverres den synergetiske effekten av hyperglykemi og haptoglobin-fenotype, noe som fører til høyere risiko.

   I longitudinelle studier utført i andre populasjoner har det blitt sett at Hp 2-2 genotype er assosiert med en 2-5 ganger økt risiko for hendelse av hjerte-kar-sykdom hos individer med DM. Spesielt studien med sterkt hjerte var oddsratioen for å ha CVD i DM med Hp 2-2-fenotypen 2-5 ganger større enn i DM med Hp 2-1-fenotype (p=0,002). I Munich Stent-studien ble en påfølgende serie med 935 behandlede diabetikere fulgt opp i ett år etter stenting for alvorlige uønskede hjertehendelser. I denne studien ble haptoglobin 2-2-fenotypen sett på å være en uavhengig prediktor for alvorlige uønskede hjertehendelser. I tillegg har det blitt sett at vitamin E gir betydelig kardiovaskulær fordel for Hp 2-2 DM-pasienter i én populasjon (Israel-ICARE STUDY) og post-hoc analyse av WHS (Women Health Study) og HOPE studien for å se om Vitamin E-tilskudd i undergruppe av pasienter med haptoglobin 2-2 fenotype påvirket dødelighet viste en ikke-signifikant reduksjon i total dødelighet. Dette har ikke blitt tatt i bruk i stor grad ettersom større forsøk, og på flere populasjoner, er nødvendig for å underbygge assosiasjonen og fordelene.

   Hp fenotype og etnisitet

   I en lokal studie utført i Singapore, har det blitt sett at frekvensen av Hp-genene varierer i de forskjellige etnisitetene som følger: Kinesisk Hp1:0.330;Hp2:0.670;Hp0: 0,029; Malaysier:Hp1:0.298;Hp2:0.702 ;Hp0:0,004; Indianere Hp1: 0,167;Hp2:0,833;Hp0:0,009. Fordelingen av Hp-frekvensene har blitt sett å være ved Hardy-Weinberg-likevekt i vår befolkning, og derfor er den forventede prevalensen av Hp 2-2 rundt 30-40%. Hp-fenotypene vil bli bestemt ved TaqMan-analyse ved TTSH Research Laboratory.

   1.2 Haptoglobin genotyper og endotelfunksjon

   Endotelial dysfunksjon har fått økende oppmerksomhet som en potensiell bidragsyter til patogenesen av vaskulær sykdom ved DM. I DM2 endres den naturlige delikate balansen i frigjøringen av kontrakterende og avslappende faktorer fra endotelet, noe som bidrar til ytterligere vaskulær og endeorganskade. Nedsatt endotelfunksjon har blitt postulert å gi en endelig felles vei der flere risikofaktorer utøver sine skadelige effekter på kardiovaskulær helse og har blitt etablert som en kraftig surrogatmarkør for kardiovaskulær risiko med en studie som viser enda bedre forutsigbarhet enn Framingham-risikoskåren. EndoPAT 2000-enheten vil bli brukt da dette er etablert for å estimere endotelfunksjonen på en ikke-invasiv måte.

   Det er ingen direkte studier gjort på å se på en assosiasjon av Hp-genotyper til endotelfunksjon, i en pilotstudie der endotelfunksjonen ble vurdert ved bruk av post-iskemisk reaktiv hyperemi og strain gauge plethysmography og uttrykt som maksimal strømning etter en iskemisk periode, ble det sett at Hp 2-2 pasienter med diabetes hadde dårligere endotelfunksjon sammenlignet med ikke Hp 2-2 pasienter (450 +-50 versus 600+-40).

   1.3 Haptoglobin genotyper og CIMT (carotid intima media thickness)

   I Diabetes Heart-studien viste genetiske analyser av Hp-genotyper en assosiasjon mellom Hp 2-2-genotype og carotis intima media thickness (CIMT). Disse målingene vil bli gjort med forsøkspersonen liggende, med hodet forlenget og litt vendt mot halspulsåren undersøkt, i henhold til anbefalingene fra Mannheim CIMT-konsensus. To etterforskere har estimert CIMT i 23 individer og et Bland-Altman-plott ble plottet. og grensene for avtale mellom brukere ble funnet å være innenfor -0,1 til +0,1.

   1.4 Haptoglobin-genotyper og aortaarteriestivhet

   Selv om det ikke er gjort noen direkte studier som sammenligner Hp-genotyper og aortaarteriestivhet, ble det gjort en studie der de evaluerte den arterielle elastisiteten til store og små arterier ved å bruke pulsbølgekonturanalysemetoden. Den store arterie-elastisitetsindeksen var lavere hos pasienter med Hp 2-2 sammenlignet med Hp 1-1 (8,4 +-2,3 ml/mmHg versus 12,6 +-4,1 ml/mmHg x 100; p

   Økt vaskulær stivhet har blitt sett tidlig i løpet av diabetes mellitus type 2 ved bruk av sphygmocor-apparat. Det er sannsynlig at denne stivheten er relatert til endotelial dysfunksjon snarere enn strukturelle vaskulære endringer - dette antyder igjen at den er reversibel. Aortapulsbølgehastighet (PWV), et mål på aortadistenbilitet, har også blitt sett å forutsi dødelighet hos pasienter med diabetes uavhengig av kjente forstyrrende faktorer. SphygmoCor Xcel-enheten for å estimere aortaarteriestivheten ved hjelp av pulsbølgehastigheten fra carotis til femoral og sentralt aortatrykk vil bli brukt. Forskerne vil estimere pulsbølgehastigheten hos 20 individer for å etablere grensene for samsvar ved å bruke Bland-Altman-plottet før studien starter.

   1.5 Haptoglobin genotyper og vaskulære markører

   Vaskulært celleadhesjonsmolekyl-1 (VCAM-1) og intercellulært adhesjonsmolekyl-1 (ICAM-1) er proteiner uttrykt på overflaten av aktiverte endotelceller (ECs) og uttrykt i tidlig aterosklerose. Disse markørene har blitt evaluert og ansett som gode markører for endoteldysfunksjon fordi en del av proteinet avgis i sirkulasjonen og kan påvises i perifert plasma.

   1.6 Haptoglobin-genotyper og fenotyping av plasmalipider

   Hp 2-2 fenotype har vært assosiert med høyere oksidert LDL-konsentrasjon, som primært er involvert i åreforkalkning. Konsentrasjonene av Apo-A1 HDL er også kjent for å være høyere hos denne pasientgruppen. Hp 2-2-fenotype kan også være assosiert med høyere Lp(a)-konsentrasjoner som gir disse pasientene høyere kardiovaskulær risiko. Detaljert fenotyping av plasmalipider ved bruk av proteomikk for å se etter nye assosiasjoner vil bli gjort.

   1.7 Haptoglobin-genotyper og oksidativt stress

   Det er kjent at Hp 2-2 genotype gir en høyere oksidativt stress på endotelet. Det totale oksidative potensialet vil bli beregnet som oksidativ-INDEKS. To tester vil bli utført som følger for å beregne denne indeksen. Denne indeksen er etablert som et godt estimat for det totale oksidative stresset.

   1. d-ROM-test: Denne testen vil bli utført på serumprøver ved å bruke automatisert d-ROM-metode. (Vassalle C, Pratali L, Boni C, Mercuri A, Ndreu R. En oksidativt stress-score som et kombinert mål på pro-oksidant- og antioksidantmotpartene hos pasienter med koronarsykdom. Clin Biochem 2008;41:1162-7)
   2. FRAP (ferric reducing ability of plasma - et mål på plasmaets evne til å forhindre skade på kar) og d-ROMs (derivater for Reactive Oxygen Metabolites) test vil bli brukt for å beregne poengsummen for oksidativ stress.

   Andre markører for oksidativt stress vil også bli målt som glyoksal, metylglyoksal, asymmetrisk dimetylarginin og homoarginin.

   1.8 Haptoglobin genotyper og retinal arteriovenøs indeks

   Tilstedeværelsen av retinale mikrovaskulære abnormiteter, spesielt arteriell innsnevring og venulær dilatasjon, har vært assosiert med økt kardiovaskulær risiko og har vært assosiert med endotelial dysfunksjon og inflammasjon. Foreløpig er det ingen studier som ser på sammenhengen mellom Hp-genotyper og retinal arteriovenøs (AV) indeks. . Før undersøkelsene vil det bli dryppet inn øyedråper for å utvide pupiller for fundusundersøkelse og for å smøre hornhinnen. Netthinneavbildning vil bli gjort for forsøkspersonene ved øyeklinikken. Hvis pasienter ikke ønsker å delta i netthinneavbildningen, kan de velge å velge bort netthinneavbildningstesten.

   2.0 Vitamin E, haptoglobin fenotype og kardiovaskulær risikoreduksjon

   Mens funksjonelle forskjeller mellom Hp1 og Hp2 allelproteinprodukter spesielt i DM kan forklare forskjellene i mottakelighet for komplikasjoner hos Hp 2-2 individer fra ikke Hp 2-2 individer, er hovedårsaken til den unike fordelen med vitamin E at redoksaktiv Hb er assosiert med HDL kun hos Hp 2-2 DM individer. Hos pasienter med DM resulterer reduserte Hp-Hb-komplekser i økt Hp-Hb-binding til Apo-A1 på high-density lipoprotein (HDL), og binder derved den prooksidative hem-delen til HDL. HDL hos Hp 2-2 DM-individer er mangelfull i sin evne til å stimulere omvendt overføring av kolesterol fra makrofager. Foruten disse er Hp-fenotypen 2-2 assosiert med økt oksidativt stress på grunn av mangelfull clearance av frie radikaler og økt LDL-peroksidasjon.

   Vitamin E er en potent antioksidant med anti-inflammatoriske egenskaper. Den lindrer betydelig tilstanden med oksidativt stress ved både dens kraftige frie radikalfjernende egenskaper og ved å interagere direkte og sterkt med antioksidantenzymer. Vitamin E-tilskudd i mennesker og dyremodeller har vist å redusere lipidperoksidasjon, superoksidproduksjon og redusere uttrykket av scavenger-reseptorer (SR-A og CD36) som er spesielt viktige i dannelsen av skumceller. Selv om vitamin E ikke har vist seg å være nyttig for å redusere kardiovaskulær risiko i den generelle befolkningen, har det vært nyttig hos pasienter med Hp 2-2 fenotype med DM, begge tilstander som øker oksidativt stress betydelig i studier utført i en populasjon.

   Det har vært bare tre intervensjonelle randomiserte kontrollerte studier (RCT) der den eneste antioksidanten som DM-deltakerne fikk var vitamin E og hvor Hp-typen av studiedeltakerne ble bestemt. ICARE-studien var den eneste RCT som hadde som mål å evaluere vitamin E hos DM-pasienter der Hp-genotypen ble prospektivt samlet inn. I denne studien ble 1434 DM-individer > eller = 55 år med Hp 2-2-fenotypen randomisert til vitamin E (400 IE/dag/placebo). Det primære sammensatte resultatet ble signifikant redusert hos individer som fikk vitamin E (2,2 %) sammenlignet med placebo (4,7 %, p=0,001) 18 måneder etter oppstart av studien da den ble avsluttet. I tillegg ble blodprøver fra en undergruppe av pasienter rekruttert til WHS- og HOPE-studiene analysert for Hp-polymorfisme, og resultatene ble revurdert i henhold til pasientens Hp-type. I alle disse studiene ble det sett en høyere risiko for kardiovaskulære hendelser hos Hp 2-2-individer og en fordel med vitamin E-tilskudd ble sett i denne gruppen.

   2.1 Begrunnelse for dose og varighet av vitamin E (alfa-tokoferol).

   Vi vil bruke vitamin E 400 IE per dag og matchet placebo. Vi vil oppdrage selskapet Beacons som skal tilberede vitamin E-kapslene (400 IE) og de matchende placebo-kapslene. Vitamin E-preparat vil være det naturlige tokoferolet som forekommer i RRR-konfigurasjonen. Vi vil gi vitamin E 400 IE i 6 måneder ettersom de fleste studier med surrogatmarkører for kardiovaskulær risiko har sett en forbedring i 6 måneder etter tilskudd. I tillegg, i ICARE-studien nevnt ovenfor, ble det sett en forbedring i kardiovaskulært utfall etter 18 måneder, noe som tyder på at 6 måneder bør være tilstrekkelig varighet for å se en forbedring i surrogatmarkører for kardiovaskulær risiko.

   De åtte formene for vitamin E er delt inn i to grupper; fire er tokoferoler og fire er tokotrienoler. De identifiseres med prefikser alfa- (α-), beta- (β-), gamma- (γ-) og delta- (δ-). alfa-tokoferol er den mest tallrike formen i naturen, kjent for å ha den høyeste biologiske aktiviteten basert på føtale resortion-analyser og reverserer vitamin E-mangelsymptomer hos mennesker. Naturlige tokoferoler forekommer kun i RRR-konfigurasjonen. Den syntetiske formen inneholder åtte forskjellige stereoisomerer og kalles 'all-rac'-α-tokoferol.

   Vitamin E finnes i sin naturlige form i vegetabilske oljer (hvetekim-, solsikke-, saflor-, mais- og soyaoljer), nøtter (mandler, peanøtter og hasselnøtter), frø (solsikkefrø), grønne bladgrønnsaker (spinat og brokkoli) og beriket frokostblandinger, fruktjuicer, margarin og pålegg. Institutt for medisin anbefalte inntak for enkeltpersoner er omtrent 15 mg/dag. Det høyeste sikre nivået av vitamin E-tilskudd for voksne er 1500 IE/dag for naturlige former for vitamin E, og 1000 IE/dag for den menneskeskapte (syntetiske) formen. Populære vitamin E-tilskudd tilgjengelig inkluderer D-alfa-tokoferol som er avledet fra naturlige oljer. Kommersielt tilgjengelige vitamin E-tilskudd inneholder vanligvis bare alfa-tokoferol gitt enten uesterifisert eller som esteren av acetat, succinat eller nikotinat. Hos mennesker har fri og forestret alfa-tokoferol samme biotilgjengelighet. Kosttilskudd kan inneholde enten naturlig RRR- eller syntetisk (all-rac) alfa-tokoferol. Den biologiske aktiviteten til naturlig RRR alfa-tokoferol er høyere enn for syntetisk all-rac-alfa-tokoferol og andre naturlige former for vitamin E.

   Både oksidativt stress og individuell genetisk sammensetning bidrar til vitamin E-homeostase hos mennesker, og dette kan være ansvarlig for de variable kliniske effektene sett i forbedring av kliniske variabler i kliniske studier. Vitamin E absorberes i tarmen, kommer inn i sirkulasjonen via lymfesystemet hvor det absorberes sammen med lipider, pakkes inn i chylomikroner og transporteres til leveren. Etter passasje gjennom leveren vises fortrinnsvis kun alfa-tokoferol i plasma, og de fleste andre former for vitamin E metaboliseres fortrinnsvis og enten utskilles i gallen eller ikke tas opp og utskilles i feces. I leveren sorterer hepatisk alfa-tokoferoloverføringsprotein (α-TTP) spesifikt ut α-formen med 2R-stereoisomerene. Plasma RRR-α-tokoferol inkorporering er en metningsbar prosess. Plasmanivåer av RRR-α-tokoferol slutter å øke ved omtrent 80 μM til tross for økende doser av vitamin E-tilskudd på opptil 1320 mg all-rac-α-tokoferol per dag. Dette er sannsynligvis sekundært til den raske erstatningen av sirkulerende med nylig absorbert α-tokoferol, og kinetiske analyser viser at hele poolen av α-tokoferol erstattes daglig. Hos mennesker er den foretrukne akkumuleringen av α-tokoferol i kroppen avhengig av både en funksjonell α-TTP og økt metabolisme og utskillelse av ikke-α-tokoferoler. Alfa-tokoferoloverføringsproteinet regulerer distribusjon av hele kroppen og konsentrasjoner av vitamin E ved å kontrollere utskillelsen av vitamin E fra leveren. Det har blitt sett at uttrykket av alfa-tokoferoloverføringsproteingenet kan induseres av oksidativt stress og hypoksi, av agonister av kjernereseptoren PPARa og RXR, og ved å øke cAMP-nivåer. Dette formidles av en allerede tilstedeværende transkripsjonsfaktor kalt cAMP respons element-bindende (CREB) transkripsjonsfaktor. Enkeltnukleotidpolymorfismer som ofte finnes hos friske mennesker påvirker promoteraktivitet drastisk.

   Ulike doser av vitamin E fra 400 IE til 2000 IE har blitt brukt i kliniske studier. Institutt for medisin, USA foreslår et anbefalt diettinntak (RDA) på 15-1000 mg/dag (1 mg =1,5 IE; 22,5-1500 IE/dag). Vi bruker en dose på 400 IE i seks måneder. Det er ingen bevis for bivirkninger hvis det tas innenfor RDA, men det kan være blødningstoksisitet i høye doser, spesielt hos pasienter på antikoagulantia. Derfor vil vi ekskludere pasienter på antikoagulantia.

   3.0 Statistiske hensyn

   3.1 Beregning av prøvestørrelse: Den samlede estimerte prøvestørrelsen for studien er 300 pasienter. Den nødvendige prøvestørrelsen på 100 for hvert Hp-fenotypelag i RCT-fasen er basert på: 5 % type I-feil; 90 % kraft; antakelsen om at vitamin E forventes å ha minst en moderat effekt, representert ved en standardisert effektstørrelse (gjennomsnittlig forskjell/poolet standardfeil) på 0,5, på hver risikomarkør; to prøver t-test med lik varians; og en frafallsrate på 15 %. Forutsatt 35 % prevalens av Hp 2-2 i vår befolkning, må vi screene 300 pasienter for å rekruttere 100 Hp 2-2 fenotypepasienter.

   Forutsatt en gjennomsnittlig forskjell på RHI på 0,25 enheter med tilsvarende standardavvik (SD) på 0,3 - gir en standardisert effektstørrelse på 0,25/0,3 = 0,83 som minimal forskjell i RHI sett i en annen studie. Vi justerte ikke for flere tester/sammenligninger på grunn av pilotkarakteren til RCT, så vel som den utforskende karakteren til studien generelt.

   Prøvestørrelsen for in vitro-studien er begrenset av begrensede ressurser. Likevel indikerer simuleringsresultater basert på en tosidig Wilcoxon Signed-Ranked test, 5 % type I feil, en korrelasjon mellom par på 0,5 og 5000 Monte Carlo simuleringsprøver at 20 par gir tilstrekkelig kraft til å oppdage moderate til store standardiserte effektstørrelser (M1).

   Randomisering vil skje elektronisk gjennom nettet – en sentralisert passordbeskyttet intranettside for å sikre at pasientene blir randomisert i det øyeblikket de er kvalifisert for forsøket (strengt sekvensielt). En blokkert randomiseringsplan vil bli brukt, i blokker på 10, for studien basert på et tildelingsforhold på 1:1. Det dedikerte passordbeskyttede nettstedet vil deretter tildele et unikt pasientforsøksnummer som vil tilsvare behandlingsnumrene som er merket i medikamentboksene. Etter randomisering vil den første dosen gis til pasienten.

   3.2 Datahåndtering og statistiske analyser: Datahåndtering Alt relevant vil bli samlet inn ved hjelp av passende godt utformede studiedatainnsamlingsskjemaer ved hvert besøk og telefonoppfølgingsvurdering. Alle studiedata vil bli lagret i en studiedatabase som kun kan vurderes for dataregistrering og datavalideringsstudiepersonell.

   Plan for statistisk analyse Data om demografiske og kliniske grunnvariabler samt risikomarkører vil bli oppsummert av Hp-fenotyper og generelt for å gi innsikt i potensielle assosiasjoner. Binære data vil bli oppsummert ved hjelp av frekvens og proporsjoner. Chi-square test og Fisher eksakt test vil bli brukt for å evaluere relevante assosiasjoner (inkludert fordelene med vitamin E), og om nødvendig vil logistisk regresjon bli brukt for å karakterisere assosiasjoner mens det justeres for potensielle konfoundere. Kontinuerlige variabler vil bli oppsummert ved bruk av middel (standardavvik) eller median (område) som anses hensiktsmessig. To eksempler på t-test eller Mann-Whitney tester vil bli brukt for å evaluere relevante assosiasjoner og generaliserte lineære modeller vil bli brukt for å karakterisere assosiasjoner mens det justeres for potensielle konfoundere. Generaliserte lineære modeller vurderes ettersom de kan romme ikke-normale (asymmetriske) data eller log-normale data (som laboratoriedata) om nødvendig. Separate tester og modeller vil bli utført for hvert relevant resultat.

   Data fra in vitro-studien vil bli oppsummert på samme måte som beskrevet i forrige avsnitt, ved Hp 2-2 fenotypestatus og vitamin E-konsentrasjoner. Wilcoxon Signed-Ranked test vil bli brukt til å evaluere fordelene med vitamin E mellom Hp-fenotypegrupper etter konsentrasjoner. Mann-Whitney og Jonckheere-Terpstra-testen vil bli brukt til å evaluere konsentrasjon-nytte-forholdet til vitamin E av Hp-fenotypegrupper. Generaliserte lineære blandede modeller vil bli brukt for å utforske ulike trender og assosiasjoner mens de tar hensyn til (i) matching av Hp 2-2 og ikke Hp 2-2 pasienter, (ii) gjentatt vurdering i en pasient etter vitamin E-konsentrasjon, (iii) justering for potensielle konfoundere, og (iv) justering for potensiell ikke-normalitet (asymmetri) av dataene ved å bruke andre passende distribusjoner som log-normal- eller gamma-fordelinger. En overordnet analyse av dataene fra in vitro-studier vil bli gjort.

   Bland-Altman analyse vil bli brukt til å estimere og evaluere grensene for enighet for avtalen og reliabilitetsstudier. Der det er hensiktsmessig, vil en blandet modelltilnærming bli brukt for å estimere og evaluere de relevante pålitelighetskoeffisientene.

   5.0 Klinisk betydning

   Dersom det sees en assosiasjon mellom Hp 2-2 fenotype med kardiovaskulær risiko, kan denne gruppen pasienter målrettes mot vitamin E behandling i tillegg til statiner og annen konvensjonell behandling for å redusere kardiovaskulær risiko. Fremtidig storskala landsdekkende RCT kan planlegges for å se om vitamin E-behandling bidrar til å redusere risikoen hos denne pasientgruppen. Å gjennomføre slike studier i en multietnisk befolkning er avgjørende, da det gir innsikt i konsistensen og generaliserbarheten til de forventede fordelene.