Relação do fenótipo da haptoglobina com a função vascular e resposta à suplementação de vitamina E em pacientes com diabetes mellitus tipo 2: o estudo EVAS (EVAS)

1.0 Antecedentes e significado clínico 1.1 Introdução A incidência de Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2) está crescendo rapidamente em todo o mundo e em Cingapura. A principal causa do aumento da morbimortalidade em pacientes com DM2 é o desenvolvimento de complicações micro e macrovasculares. Embora tenha sido comprovado que o controle glicêmico estrito reduz as complicações microvasculares, ainda faltam evidências em relação às complicações macrovasculares. A aterosclerose acelerada é a principal causa de aumento da mortalidade e morbidade nesses pacientes. É de suma importância avaliar novos alvos para controlar a aterosclerose em pacientes com DM2 em adição ao tratamento convencional. Há uma necessidade não atendida de encontrar novos alvos ou marcadores que prevejam risco aumentado em pacientes com diabetes mellitus e precisamos considerar tratamentos alternativos além dos alvos convencionais para reduzir o risco nesses pacientes do grupo de alto risco.

Os pacientes com DM2 não apenas apresentam um risco aumentado de aterosclerose, mas também carregam uma extensão maior da carga da doença. A disfunção endotelial é considerada a marca registrada do insulto patológico infligido aos vasos sanguíneos. A hiperglicemia afeta as vias mitocondriais, enzimáticas e não enzimáticas associadas à geração de espécies reativas de oxigênio (ROS), levando à diminuição da biodisponibilidade do óxido nítrico e à disfunção endotelial, comumente demonstrada pela redução da vasodilatação dependente do endotélio e aumento dos níveis plasmáticos de proteínas reguladoras derivadas do endotélio. Além disso, pacientes com DM2 apresentam defesas antioxidantes comprometidas na forma de baixos níveis de enzimas antioxidantes e alfa-tocoferol (vitamina E), o que pode impedir uma compensação adequada para o aumento do estresse oxidativo. Outro papel do estresse oxidativo na mediação do desenvolvimento da aterosclerose também foi demonstrado na hipótese oxidativa. Neste modelo, o alvo mais proeminente para a modificação oxidativa é a molécula de LDL. O LDL oxidado não é reconhecido pelo receptor de LDL, mas é prontamente captado pela via do receptor scavenger CD36 em macrófagos, levando a um acúmulo apreciável de éster de colesterol e formação de células espumosas. A LDL oxidada é pró-inflamatória, causa inibição da NO sintetase endotelial, promove vasoconstrição e adesão de monócitos e promove agregação plaquetária e trombose.

Fenótipo Hp e dano tecidual oxidativo

A proteína haptoglobina (Hp) é um antioxidante devido à sua capacidade de neutralizar a atividade oxidativa da hemoglobina (Hb). Em humanos, a Hp é caracterizada por um polimorfismo genético com três fenótipos estruturalmente diferentes (Hp1-1, Hp 2-1 e Hp 2-2 que resultam da expressão de dois alelos diferentes (Hp 1 e Hp 2) do gene da haptoglobina localizado na cromossomo 16q22. O produto proteico do alelo Hp2 é um antioxidante inferior em comparação com o produto do alelo Hp1. A Hp 1-1 é uma molécula pequena (86kDa) de estrutura bem definida, enquanto a Hp 2-1 é caracterizada por heteropolímeros (86-300 kDA) e a Hp 2-2 forma grandes complexos macromoleculares (170-1.000 kDa).

A função da Hp é ligar a Hb livre liberada pelos glóbulos vermelhos, que é liberada no sangue durante a renovação natural dos glóbulos vermelhos. A Hb livre é capaz de causar dano tecidual oxidativo considerável em decorrência de seu ferro heme. No entanto, sempre que a Hb é liberada na circulação, ela imediatamente se liga à Hp com afinidade extremamente alta para formar um complexo Hp-Hb. Essa ligação serve para inibir o potencial oxidativo da Hb, impedindo a liberação de ferro heme da Hb. A Hp é normalmente encontrada no sangue em um excesso molar de mais de 400 vezes em relação à Hb livre e, portanto, a Hp é capaz de ligar toda a Hb que é liberada durante a renovação normal dos glóbulos vermelhos. Uma vez que a Hb esteja ligada à Hp, ela é rapidamente eliminada da corrente sanguínea por meio do receptor scavenger CD163 expresso em monócitos/macrófagos; no entanto, a formação e a eliminação dos complexos Hp-Hb são prejudicadas nos fenótipos Hp 2-2.

O ferro derivado da Hb pode catalisar uma série de reações oxidativas que podem ser inibidas pela Hp.

1. Ferro heme ferroso (Fe2+) pode reagir com peróxido de hidrogênio para produzir Hb férrica (Fe3+) e as espécies de radicais hidroxila altamente reativas. Ao abstrair um átomo de hidrogênio dos ácidos graxos poliinsaturados, os radicais hidroxila podem iniciar o processo de peroxidação lipídica.
2. Hb ferrosa (Fe2+) também pode reagir com peróxido de hidrogênio para produzir Hb ferril (Fe4+), uma molécula altamente instável que reage prontamente com uma segunda molécula de peróxido de hidrogênio para produzir Hb férrica (Fe3+) e ânion superóxido. Os efeitos nocivos do ânion superóxido são duplos: redução do ferro férrico (Fe3+) em Hb para ferro ferroso (Fe2+), permitindo a produção de radical hidroxila adicional, conforme descrito na reação 1, e dismutação do ânion superóxido para produzir peróxido de hidrogênio , novamente promovendo a produção de ROS.

3. A Hb férrica (contendo Fe3+), também conhecida como metahemoglobina, pode transferir espontaneamente sua porção heme, resultando na entrada de heme em diversos ambientes lipofílicos, como LDL ou membranas celulares. Uma vez intercalado em seu novo ambiente lipídico, o ferro heme pode sofrer reações com peróxido de hidrogênio como descrito acima ou com peróxidos lipídicos adjacentes, gerando uma cascata de radicais livres e levando a extensa oxidação lipídica.

   Como parte do complexo Hp-Hb, a Hp estabiliza o heme na bolsa heme da Hb e evita que a Hb cause lesão oxidativa. No entanto, o grau em que a Hp neutraliza a atividade redox do ferro heme difere entre os tipos de Hp. Isso foi demonstrado em vários sistemas in vitro e in vivo. Por exemplo, estudos usando ácido linolênico mostraram que Hp 1-1 impediu a oxidação (formação de dieno) conforme medido por um aumento na absorbância a 232 nm em maior extensão do que Hp 2-2. Outro estudo examinou a oxidação de LDL devido à transferência de heme de Hb para LDL. A transferência de heme foi medida pela supressão do sinal de fluorescência emitido pela LDL dansilada. Verificou-se que a Hp 1-1 foi superior na prevenção da transferência de heme da Hb em comparação com a Hp 2-2.

   Fenótipos Hp e estudos de risco cardiovascular mostraram que os complexos Hp 2-2 Hb também são eliminados com menos eficiência do que os complexos não Hp 2-2 Hb. Em pacientes com DM2 esse fenômeno é mais pronunciado devido à regulação negativa de CD163, particularmente em indivíduos Hp 2-2. Um comprometimento na sinalização de macrófagos antiinflamatórios por meio de um eixo CD163/pAkt/IL-10 também é observado em pacientes com Hp 2-2.

   A depuração deficiente de Hp-Hb em indivíduos Hp 2-2 DM2 resulta em aumento da ligação de Hp-Hb a Apo A1 na lipoproteína de alta densidade (HDL-C), ligando assim a porção heme pró-oxidativa ao HDL. Isso o torna deficiente em sua capacidade de reverter a transferência de colesterol dos macrófagos.

   A proteína Hp 2-2 é menos eficiente no bloqueio da transferência de heme da Hb em comparação com a Hp 1-1. Além disso, o aumento na transferência de heme quando a Hb é glicosilada pode fornecer uma explicação mecanicista para o aumento da doença cardiovascular observada em Hp 2-2 DM2.

   Portanto, o fenótipo Hp 2-2 está associado à diminuição da capacidade de se ligar à Hb, diminuição da depuração dos complexos Hp 2-2 Hb, comprometimento da via de sinalização anti-inflamatória, aumento da oxidação de LDL, torna o colesterol HDL ineficiente e menos eficiente no bloqueio da transferência de heme de Hb para Hp 1-1, todos levando a um maior risco cardiovascular. Em pacientes com diabetes, onde algumas dessas vias também são afetadas, o efeito sinérgico da hiperglicemia e o fenótipo da haptoglobina são exacerbados, levando a um risco maior.

   Em estudos longitudinais realizados em outras populações, observou-se que o genótipo Hp 2-2 está associado a um risco 2-5 vezes maior de incidência de DCV em indivíduos com DM. Em particular, no estudo do coração forte, a razão de chance de ter DCV em DM com fenótipo Hp 2-2 foi 2-5 vezes maior do que em DM com fenótipo Hp 2-1 (p=0,002). No estudo Munich Stent, uma série consecutiva de 935 indivíduos diabéticos tratados foram acompanhados por um ano após o implante de stent para eventos cardíacos adversos maiores. Neste estudo, o fenótipo da haptoglobina 2-2 foi visto como um preditor independente de eventos cardíacos adversos maiores. Além disso, foi observado que a vitamina E oferece benefícios cardiovasculares substanciais para pacientes com Hp 2-2 DM em uma população (Israel-ICARE STUDY) e análise post-hoc do WHS (Women Health Study) e estudo HOPE para ver se a vitamina A suplementação com E no subgrupo de pacientes com o fenótipo haptoglobina 2-2 influenciou a mortalidade mostrou uma redução não significativa na mortalidade total. Isso não foi amplamente adotado, pois estudos maiores e em várias populações são necessários para comprovar a associação e os benefícios.

   Fenótipo e Etnia Hp

   Em um estudo local feito em Cingapura, foi observado que a frequência dos genes Hp varia nas diferentes etnias da seguinte forma: Chinês Hp1:0,330;Hp2:0,670;Hp0: 0,029; Malaios:Hp1:0,298;Hp2:0,702 ;Hp0:0,004; Índios Hp1: 0,167;Hp2:0,833;Hp0:0,009. A distribuição das frequências de Hp está em equilíbrio de Hardy-Weinberg em nossa população, portanto, a prevalência esperada de Hp 2-2 é de cerca de 30-40%. Os fenótipos de Hp serão determinados por análise TaqMan no TTSH Research Laboratory.

   1.2 Genótipos de haptoglobina e função endotelial

   A disfunção endotelial tem recebido atenção crescente como um potencial contribuinte para a patogênese da doença vascular na DM. No DM2, o delicado equilíbrio natural na liberação de fatores de contração e relaxamento pelo endotélio é alterado, o que contribui para mais danos vasculares e de órgãos-alvo. Foi postulado que a função endotelial prejudicada fornece um caminho final comum pelo qual múltiplos fatores de risco exercem seus efeitos deletérios na saúde cardiovascular e foi estabelecido como um poderoso marcador substituto para o risco cardiovascular com um estudo mostrando previsibilidade ainda melhor do que o escore de risco de Framingham. O dispositivo EndoPAT 2000 será usado, pois foi estabelecido para estimativa da função endotelial de maneira não invasiva.

   Não há estudos diretos sobre a associação de genótipos de Hp à função endotelial, em um estudo piloto em que a função endotelial foi avaliada usando hiperemia reativa pós-isquêmica e pletismografia de medidor de tensão e expressa como fluxo máximo após um período isquêmico, foi observado que os pacientes Hp 2-2 com diabetes tinham pior função endotelial em comparação com os pacientes não Hp 2-2 (450 +-50 versus 600 +-40).

   1.3 Genótipos de haptoglobina e CIMT (espessura da camada íntima da carótida)

   No estudo Diabetes Heart, as análises genéticas dos genótipos Hp mostraram uma associação entre o genótipo Hp 2-2 e a espessura da camada íntima da carótida (CIMT). Essas medições serão feitas com o indivíduo deitado, com a cabeça estendida e ligeiramente voltada para o lado oposto à carótida examinada, seguindo as recomendações do consenso Mannheim CIMT. Dois investigadores estimaram a EIMC em 23 indivíduos e um gráfico de Bland-Altman foi traçado e os limites de acordo entre usuários foram encontrados entre -0,1 e +0,1.

   1.4 Genótipos de haptoglobina e rigidez da artéria aórtica

   Embora não haja estudos diretos comparando os genótipos de Hp e a rigidez da artéria aórtica, foi feito um estudo no qual eles avaliaram a elasticidade arterial de grandes e pequenas artérias usando o método de análise de contorno de onda de pulso. O índice de elasticidade das grandes artérias foi menor em pacientes com Hp 2-2 em comparação com Hp 1-1 (8,4 +-2,3 ml/mmHg versus 12,6 +-4,1 ml/mmHg x 100; p

   O aumento da rigidez vascular foi observado no início do curso do Diabetes Mellitus tipo 2 usando o dispositivo esfigmocor. É provável que essa rigidez esteja relacionada à disfunção endotelial e não a alterações vasculares estruturais - isso, por sua vez, sugere que ela é reversível. A velocidade da onda de pulso aórtico (VOP), uma medida da distensibilidade aórtica, também foi vista como preditora de mortalidade em pacientes com diabetes, independentemente de fatores de confusão conhecidos. O dispositivo SphygmoCor Xcel para estimar a rigidez da artéria aórtica usando a velocidade da onda de pulso carótida para femoral e a pressão aórtica central será usado. Os investigadores estimarão a velocidade da onda de pulso em 20 indivíduos para estabelecer os limites de concordância usando o gráfico de Bland-Altman antes de iniciar o estudo.

   1.5 Genótipos de haptoglobina e marcadores vasculares

   A molécula-1 de adesão celular vascular (VCAM-1) e a molécula-1 de adesão intercelular (ICAM-1) são proteínas expressas na superfície de células endoteliais (ECs) ativadas e expressas na aterosclerose precoce. Esses marcadores têm sido avaliados e considerados bons marcadores de disfunção endotelial, pois parte da proteína é liberada na circulação e pode ser detectada no plasma periférico.

   1.6 Genótipos de haptoglobina e fenotipagem de lipídios plasmáticos

   O fenótipo Hp 2-2 tem sido associado a concentrações mais elevadas de LDL oxidado, que está principalmente envolvido na aterosclerose. As concentrações de Apo-A1 HDL também são conhecidas por serem mais altas nesse grupo de pacientes. O fenótipo Hp 2-2 também pode estar associado a concentrações mais altas de Lp(a), colocando esses pacientes em maior risco cardiovascular. Fenotipagem detalhada de lipídios plasmáticos usando proteômica para procurar novas associações será feita.

   1.7 Genótipos de Haptoglobina e Estresse Oxidativo

   Sabe-se que o genótipo Hp 2-2 confere maior estresse oxidativo ao endotélio. O potencial oxidativo total será calculado como o Oxidative-INDEX. Dois testes serão feitos da seguinte forma para calcular esse índice. Este índice foi estabelecido como uma boa estimativa do estresse oxidativo geral.

   1. Teste de d-ROMs: Este teste será realizado em amostras de soro usando o método automatizado de d-ROMs. (Vassalle C, Pratali L, Boni C, Mercuri A, Ndreu R. Uma pontuação de estresse oxidativo como uma medida combinada das contrapartes pró-oxidantes e antioxidantes em pacientes com doença arterial coronariana. Clin Biochem 2008;41:1162-7)
   2. O teste FRAP (capacidade de redução férrica do plasma - uma medida da capacidade do plasma de prevenir danos aos vasos) e d-ROMs (derivados para os Metabólitos Reativos de Oxigênio) será usado para calcular o escore de estresse oxidativo.

   Outros marcadores de estresse oxidativo também serão medidos como glioxal, metilglioxal, dimetilarginina assimétrica e homoarginina.

   1.8 Genótipos de haptoglobina e índice arteriovenoso da retina

   A presença de anormalidades microvasculares da retina, especialmente constrição arterial e dilatação venular, foi associada a um risco cardiovascular aumentado e à disfunção endotelial e inflamação. Atualmente, não há estudos que analisem a relação entre os genótipos de Hp e o índice arteriovenoso (AV) retiniano. . Antes das investigações, serão instilados colírios para dilatar as pupilas para exame de fundo de olho e para lubrificar a córnea. A imagem da retina será feita para os indivíduos na clínica oftalmológica. Se os pacientes não desejarem participar do exame de imagem da retina, eles podem optar por não participar do teste de imagem da retina.

   2.0 Vitamina E, fenótipo da haptoglobina e redução do risco cardiovascular

   Embora as diferenças funcionais entre os produtos de proteínas alélicas Hp1 e Hp2, particularmente no DM, possam explicar as diferenças na suscetibilidade a complicações nos indivíduos Hp 2-2 de indivíduos não Hp 2-2, a principal razão do benefício exclusivo da vitamina E é que a Hb ativa redox está associada com HDL apenas em indivíduos DM Hp 2-2. Em pacientes com DM, a diminuição dos complexos Hp-Hb resulta em aumento da ligação de Hp-Hb a Apo-A1 na lipoproteína de alta densidade (HDL), ligando assim a porção heme pró-oxidativa ao HDL. O HDL em indivíduos DM Hp 2-2 é deficiente em sua capacidade de estimular a transferência reversa de colesterol dos macrófagos. Além destes, o fenótipo Hp 2-2 está associado ao aumento do estresse oxidativo devido à deficiência na depuração de radicais livres e aumento da peroxidação de LDL.

   A vitamina E é um potente antioxidante com propriedades anti-inflamatórias. Alivia significativamente a condição de estresse oxidativo por suas potentes propriedades de eliminação de radicais livres e por interagir direta e fortemente com as enzimas antioxidantes. A suplementação de vitamina E em modelos humanos e animais demonstrou diminuir a peroxidação lipídica, a produção de superóxido e diminuir a expressão de receptores scavenger (SR-A e CD36), que são particularmente importantes na formação de células espumosas. Embora a vitamina E não tenha se mostrado útil na redução do risco cardiovascular na população em geral, ela tem sido útil em pacientes com fenótipo Hp 2-2 com DM, ambas as condições que aumentam substancialmente o estresse oxidativo em estudos feitos em uma população.

   Houve apenas três ensaios randomizados controlados intervencionistas (RCTs) nos quais o único antioxidante que os participantes com DM receberam foi a vitamina E e nos quais o tipo de Hp dos participantes do estudo foi determinado. O estudo ICARE foi o único ECR destinado a avaliar a vitamina E em pacientes com DM para o qual o genótipo Hp foi coletado prospectivamente. Neste estudo, 1.434 indivíduos DM > ou = 55 anos de idade com o fenótipo Hp 2-2 foram randomizados para vitamina E (400 UI/dia/placebo). O desfecho composto primário foi significativamente reduzido em indivíduos que receberam vitamina E (2,2%) em comparação com placebo (4,7%, p=0,001) 18 meses após o início do estudo, quando foi encerrado. Além disso, amostras de sangue de um subconjunto de pacientes recrutados para os estudos WHS e HOPE foram analisadas quanto ao polimorfismo de Hp e os resultados reavaliados de acordo com o tipo de Hp do paciente. Em todos esses estudos, um risco maior de eventos cardiovasculares foi observado em indivíduos com Hp 2-2 e um benefício da suplementação de vitamina E foi observado nesse grupo.

   2.1 Justificativa da dose e duração da vitamina E (alfa-tocoferol).

   Estaremos usando vitamina E 400 UI por dia e placebo correspondente. Encarregaremos a empresa Beacons de preparar as cápsulas de vitamina E (400 UI) e as cápsulas de placebo correspondentes. A preparação de vitamina E será o tocoferol natural que ocorre na configuração RRR. Daremos 400 UI de vitamina E por 6 meses, pois a maioria dos estudos usando marcadores substitutos de risco cardiovascular observou uma melhora em 6 meses após a suplementação. Além disso, no estudo ICARE mencionado acima, uma melhora no resultado cardiovascular foi observada em 18 meses, sugerindo, assim, que 6 meses devem ser uma duração adequada para observar uma melhora nos marcadores substitutos de risco cardiovascular.

   As oito formas de vitamina E são divididas em dois grupos; quatro são tocoferóis e quatro são tocotrienóis. Eles são identificados pelos prefixos alfa- (α-), beta- (β-), gama- (γ-) e delta- (δ-). alfa-tocoferol é a forma mais abundante na natureza, conhecida por ter a maior atividade biológica com base em ensaios de recorrência fetal e reverte os sintomas de deficiência de vitamina E em humanos. Os tocoferóis naturais ocorrem apenas na configuração RRR. A forma sintética contém oito estereoisômeros diferentes e é chamada de 'all-rac'-α-tocoferol.

   A vitamina E é encontrada em sua forma natural em óleos vegetais (gérmen de trigo, girassol, cártamo, milho e soja), nozes (amêndoas, amendoins e avelãs), sementes (girassol), vegetais de folhas verdes (espinafre e brócolis) e fortificados cereais matinais, sucos de frutas, margarinas e pastas. A ingestão recomendada pelo Institute of Medicine para indivíduos é de cerca de 15mg/dia. O nível seguro mais alto de suplementos de vitamina E para adultos é de 1.500 UI/dia para formas naturais de vitamina E e 1.000 UI/dia para a forma artificial (sintética). Os suplementos populares de vitamina E disponíveis incluem D-alfa-tocoferol, derivado de óleos naturais. Os suplementos de vitamina E comercialmente disponíveis geralmente contêm apenas alfa-tocoferol fornecido não esterificado ou como éster de acetato, succinato ou nicotinato. Em humanos, o alfa-tocoferol livre e esterificado têm a mesma biodisponibilidade. Os suplementos podem conter o alfa-tocoferol RRR natural ou sintético (all-rac). A atividade biológica do RRR alfa-tocoferol natural é maior do que a do all-rac-alpha-tocoferol sintético e outras formas naturais de vitamina E.

   Tanto o estresse oxidativo quanto a composição genética individual contribuem para a homeostase da vitamina E em humanos e isso pode ser responsável pelos efeitos clínicos variáveis ​​observados na melhora das variáveis ​​clínicas em ensaios clínicos. A vitamina E é absorvida no intestino, entra na circulação através do sistema linfático onde é absorvida junto com os lipídios, é acondicionada em quilomícrons e transportada para o fígado. Após a passagem pelo fígado, apenas o alfa-tocoferol aparece preferencialmente no plasma e a maioria das outras formas de vitamina E é preferencialmente metabolizada e secretada na bile ou não absorvida e excretada nas fezes. No fígado, a proteína hepática de transferência de alfa-tocoferol (α-TTP) classifica especificamente a forma α com os estereoisômeros 2R. A incorporação plasmática de RRR-α-tocoferol é um processo saturável. Os níveis plasmáticos de RRR-α-tocoferol param de aumentar em aproximadamente 80 μM, apesar do aumento das dosagens de suplementação de vitamina E de até 1.320 mg de all-rac-α-tocoferol por dia. Isso é provavelmente secundário à rápida substituição do α-tocoferol circulante por α-tocoferol recém-absorvido e análises cinéticas demonstram que todo o pool de α-tocoferol é substituído diariamente. Em humanos, o acúmulo preferencial de α-tocoferol no corpo depende de um α-TTP funcional e aumento do metabolismo e excreção de não-α-tocoferóis. A proteína de transferência de alfa-tocoferol regula a distribuição corporal e as concentrações de vitamina E, controlando a secreção de vitamina E pelo fígado. Foi observado que a expressão do gene da proteína de transferência do alfa-tocoferol pode ser induzida por estresse oxidativo e hipóxia, por agonistas do receptor nuclear PPARα e RXR e pelo aumento dos níveis de AMPc. Isso é mediado por um fator de transcrição já presente chamado fator de transcrição de ligação do elemento de resposta cAMP (CREB). Polimorfismos de nucleotídeo único comumente encontrados em pessoas saudáveis ​​afetam drasticamente a atividade do promotor.

   Várias doses de vitamina E variando de 400 UI a 2.000 UI foram usadas em ensaios clínicos. O instituto de medicina dos EUA sugere uma ingestão dietética recomendada (RDA) de 15-1.000 mg/dia (1 mg = 1,5 UI; 22,5-1.500 UI/dia). Estamos usando uma dose de 400 UI por seis meses. Não há evidência de efeitos adversos se tomado dentro da RDA. No entanto, pode haver toxicidade hemorrágica em altas doses, especialmente em pacientes em uso de anticoagulantes. Portanto, estaremos excluindo pacientes em uso de anticoagulantes.

   3.0 Considerações Estatísticas

   3.1 Cálculo do tamanho da amostra: O tamanho total da amostra estimado para o estudo é de 300 pacientes. O tamanho de amostra necessário de 100 para cada estrato do fenótipo Hp da fase RCT é baseado em: 5% de erro tipo I; 90% de potência; a suposição de que se espera que a vitamina E tenha pelo menos um efeito moderado, representado por um tamanho de efeito padronizado (diferença média/erro padrão agrupado) de 0,5, em cada marcador de risco; teste t de duas amostras com variância igual; e uma taxa de abandono de 15%. Assumindo prevalência de 35% de Hp 2-2 em nossa população, precisamos rastrear 300 pacientes para recrutar 100 pacientes com fenótipo Hp 2-2.

   Assumindo uma diferença média em RHI de 0,25 unidades com correspondente desvio padrão (DP) de 0,3 - gerando um tamanho de efeito padronizado de 0,25/0,3 = 0,83 como diferença mínima no RHI visto em outro estudo. Não ajustamos para múltiplos testes/comparações devido à natureza piloto do RCT, bem como à natureza exploratória do estudo em geral.

   O tamanho da amostra para o estudo in vitro é limitado por recursos limitados. No entanto, os resultados da simulação com base em um teste Wilcoxon Signed-Ranked bilateral, 5% de erro tipo I, uma correlação entre pares de 0,5 e 5.000 amostras de simulação de Monte Carlo indicam que 20 pares fornecem poder adequado para detectar tamanhos de efeito padronizados moderados a grandes (M1).

   A randomização será feita eletronicamente pela web - um site de intranet centralizado e protegido por senha para garantir que os pacientes sejam randomizados no momento em que forem elegíveis para o estudo (estritamente sequencial). Um cronograma de randomização em bloco será empregado, em blocos de 10, para o estudo com base em uma proporção de alocação de 1:1. O site dedicado protegido por senha alocará um número de teste de paciente exclusivo que corresponderá aos números de tratamento rotulados nas caixas de medicamentos. Após a randomização, a primeira dose será administrada ao paciente.

   3.2 Manuseio de dados e análises estatísticas: Manuseio de dados Todos os dados relevantes serão coletados usando formulários de coleta de dados de estudo bem elaborados e apropriados em cada visita e avaliação de acompanhamento por telefone. Todos os dados do estudo serão armazenados em um banco de dados do estudo avaliável apenas para entrada de dados e pessoal do estudo de validação de dados.

   Plano de análise estatística Dados sobre variáveis ​​clínicas e demográficas basais, bem como marcadores de risco, serão resumidos por fenótipos de Hp e, em geral, para fornecer informações sobre possíveis associações. Os dados binários serão resumidos usando frequência e proporções. O teste do qui-quadrado e o teste exato de Fisher serão usados ​​para avaliar associações relevantes (incluindo benefícios da vitamina E) e, se necessário, regressão logística será usada para caracterizar associações enquanto ajusta para possíveis fatores de confusão. As variáveis ​​contínuas serão resumidas usando médias (desvios padrão) ou medianas (intervalo) conforme apropriado. O teste t de duas amostras ou o teste de Mann-Whitney serão usados ​​para avaliar associações relevantes e modelos lineares generalizados serão usados ​​para caracterizar associações enquanto ajusta para potenciais fatores de confusão. Modelos lineares generalizados são considerados, pois podem acomodar dados não normais (assimétricos) ou dados log-normais (como dados de laboratório), se necessário. Testes e modelos separados serão realizados para cada resultado relevante.

   Os dados do estudo in vitro serão resumidos de forma semelhante ao descrito no parágrafo anterior, pelo status do fenótipo Hp 2-2 e concentrações de vitamina E. O teste Wilcoxon Signed-Ranked será utilizado para avaliar os benefícios da vitamina E entre grupos de fenótipos Hp por concentrações. Os testes de Mann-Whitney e Jonckheere-Terpstra serão utilizados para avaliar a relação concentração-benefício da vitamina E por grupos de fenótipos de Hp. Modelos mistos lineares generalizados serão empregados para explorar várias tendências e associações, considerando (i) a correspondência de pacientes com Hp 2-2 e não Hp 2-2, (ii) avaliação repetida dentro de um paciente pela concentração de vitamina E, (iii) ajuste para possíveis fatores de confusão e (iv) ajuste para potencial não normalidade (assimetria) dos dados usando outras distribuições apropriadas, como distribuições log-normal ou gama. Será feita uma análise global dos dados do estudo in vitro.

   A análise de Bland-Altman será utilizada para estimar e avaliar os limites de concordância para os estudos de concordância e confiabilidade. Quando apropriado, uma abordagem de modelo misto será usada para estimar e avaliar os coeficientes de confiabilidade relevantes.

   5.0 Significado clínico

   Se for observada uma associação entre o fenótipo Hp 2-2 com risco cardiovascular, esse grupo de pacientes pode ser alvo de tratamento com vitamina E além de estatinas e outros tratamentos convencionais para reduzir o risco cardiovascular. Um RCT nacional de grande escala futuro pode ser planejado para verificar se o tratamento com vitamina E ajuda a reduzir o risco nesse grupo de pacientes. A realização de tais estudos em uma população multiétnica é imperativa, pois fornece informações sobre a consistência e generalização dos benefícios esperados.