Взаимосвязь фенотипа гаптоглобина с функцией сосудов и реакцией на добавки витамина Е у пациентов с сахарным диабетом 2 типа: исследование EVAS (EVAS)

1.0 Предыстория и клиническое значение 1.1 Введение Заболеваемость сахарным диабетом 2 типа (СД2) быстро растет во всем мире и в Сингапуре. Основной причиной повышенной заболеваемости и смертности больных СД2 является развитие микро- и макрососудистых осложнений. Хотя было доказано, что строгий гликемический контроль уменьшает микрососудистые осложнения, доказательств в отношении макрососудистых осложнений все еще недостаточно. Ускоренный атеросклероз является ведущей причиной повышенной смертности и заболеваемости у этих пациентов. Крайне важно оценить новые мишени для контроля атеросклероза у пациентов с СД2 в дополнение к традиционному лечению. Существует неудовлетворенная потребность в поиске новых мишеней или маркеров, предсказывающих повышенный риск у пациентов с сахарным диабетом, и нам необходимо рассмотреть альтернативные методы лечения в дополнение к обычным мишеням, чтобы снизить риск у этих пациентов из группы высокого риска.

Пациенты с СД2 не только подвержены повышенному риску атеросклероза, но и несут большее бремя болезни. Эндотелиальная дисфункция считается отличительной чертой патологического поражения сосудов. Гипергликемия влияет на митохондриальные, ферментативные и неферментативные пути, связанные с образованием активных форм кислорода (АФК), что приводит к снижению биодоступности оксида азота и эндотелиальной дисфункции, что обычно проявляется снижением эндотелийзависимой вазодилатации и повышением уровня эндотелиальных регуляторных белков в плазме. Кроме того, у пациентов с СД2 нарушена антиоксидантная защита в виде низкого уровня антиоксидантных ферментов и альфа-токоферола (витамина Е), что может препятствовать адекватной компенсации увеличения окислительного стресса. Другая роль окислительного стресса в опосредовании развития атеросклероза также была продемонстрирована в окислительной гипотезе. В этой модели наиболее заметной мишенью для окислительной модификации является молекула ЛПНП. Окисленный ЛПНП не распознается рецептором ЛПНП, но легко поглощается рецептором-поглотителем CD36 в макрофагах, что приводит к значительному накоплению эфира холестерина и образованию пенистых клеток. Окисленный ЛПНП является провоспалительным, он вызывает ингибирование эндотелиальной NO-синтетазы, способствует вазоконстрикции и адгезии моноцитов, способствует агрегации тромбоцитов и тромбозу.

Фенотип Hp и окислительное повреждение тканей

Белок гаптоглобин (Hp) является антиоксидантом благодаря своей способности нейтрализовать окислительную активность гемоглобина (Hb). У человека Hp характеризуется генетическим полиморфизмом с тремя структурно различными фенотипами (Hp1-1, Hp 2-1 и Hp 2-2, которые являются результатом экспрессии двух разных аллелей (Hp 1 и Hp 2) гена гаптоглобина, расположенного на хромосома 16q22. Белковый продукт аллеля Hp2 является более слабым антиоксидантом по сравнению с продуктом аллеля Hp1. Hp 1-1 представляет собой небольшую молекулу (86 кДа) с четко определенной структурой, тогда как Hp 2-1 характеризуется гетерополимерами (86-300 кДа), а Hp 2-2 образует крупные макромолекулярные комплексы (170-1000 кДа).

Функция Hp заключается в связывании свободного Hb, высвобождаемого из эритроцитов, который высвобождается в кровь во время естественного оборота эритроцитов. Свободный гемоглобин способен вызывать значительное окислительное повреждение тканей в результате присутствия в нем гемового железа. Однако всякий раз, когда Hb попадает в кровоток, он немедленно связывается с Hp с чрезвычайно высоким сродством, образуя комплекс Hp-Hb. Это связывание служит для ингибирования окислительного потенциала гемоглобина, предотвращая высвобождение гемового железа из гемоглобина. В норме Hp обнаруживается в крови в более чем 400-кратном молярном избытке по отношению к свободному Hb, и, следовательно, Hp способен связывать весь Hb, который высвобождается при нормальном обмене эритроцитов. Как только Hb связывается с Hp, он быстро выводится из кровотока через рецептор-мусорщик CD163, экспрессируемый на моноцитах/макрофагах, однако образование и клиренс комплексов Hp-Hb нарушены при фенотипах Hp 2-2.

Железо, полученное из Hb, может катализировать ряд окислительных реакций, которые могут ингибироваться Hp.

1. Двухвалентное гемовое железо (Fe2+) может реагировать с перекисью водорода с образованием трехвалентного Hb (Fe3+) и высокореакционноспособных гидроксильных радикалов. Отрывая атом водорода от полиненасыщенных жирных кислот, гидроксильные радикалы могут инициировать процесс перекисного окисления липидов.
2. Двухвалентное железо Hb (Fe2+) также может реагировать с пероксидом водорода с образованием феррилового Hb (Fe4+), очень нестабильной молекулы, которая легко реагирует со второй молекулой пероксида водорода с образованием трехвалентного Hb (Fe3+) и супероксидного аниона. Повреждающее действие аниона супероксида двоякое: восстановление трехвалентного железа (Fe3+) в Hb до двухвалентного железа (Fe2+), позволяющее получить дополнительный гидроксильный радикал, как описано в реакции 1, и дисмутация аниона супероксида с образованием перекиси водорода. , снова продвигая производство ROS.

3. Железосодержащий Hb (содержащий Fe3+), также известный как метгемоглобин, может спонтанно переносить свой гем, что приводит к попаданию гема в различные липофильные среды, такие как ЛПНП или клеточные мембраны. После интеркалирования в новую липидную среду гемовое железо может вступать в реакции с перекисью водорода, как описано выше, или с соседними перекисями липидов, генерируя каскад свободных радикалов и приводя к интенсивному окислению липидов.

   Являясь частью комплекса Hp-Hb, Hp стабилизирует гем в гемовом кармане Hb и предотвращает окислительное повреждение гемоглобина. Однако степень, в которой Hp нейтрализует окислительно-восстановительную активность гемового железа, различается среди типов Hp. Это было показано в ряде систем как in vitro, так и in vivo. Например, исследования с использованием линоленовой кислоты показали, что Hp 1-1 предотвращает окисление (образование диена), что измеряется увеличением поглощения при 232 нм в большей степени, чем Hp 2-2. В другом исследовании изучалось окисление ЛПНП из-за переноса гема от гемоглобина к ЛПНП. Перенос гема измеряли по гашению сигнала флуоресценции, испускаемого дансилированными ЛПНП. Было обнаружено, что Hp 1-1 лучше предотвращает перенос гема от Hb по сравнению с Hp 2-2.

   Фенотипы Hp и риск сердечно-сосудистых заболеваний Исследования показали, что комплексы Hp 2-2 Hb также выводятся менее эффективно, чем комплексы Hp 2-2 Hb. У больных СД2 это явление более выражено за счет подавления CD163, особенно у лиц с Hp 2-2. Нарушение противовоспалительной передачи сигналов макрофагами через ось CD163/pAkt/IL-10 также наблюдается у пациентов с Hp 2-2.

   Недостаточный клиренс Hp-Hb у людей с СД2 Hp 2-2 приводит к повышенному связыванию Hp-Hb с Apo A1 на липопротеине высокой плотности (HDL-C), тем самым привязывая прооксидантную часть гема к HDL. Это делает его недостаточным в его способности обратного переноса холестерина из макрофагов.

   Белок Hp 2-2 менее эффективно блокирует перенос гема от Hb по сравнению с Hp 1-1. Кроме того, увеличение переноса гема при гликозилировании гемоглобина может обеспечить механистическое объяснение увеличения сердечно-сосудистых заболеваний, наблюдаемых при СД2 Hp 2-2.

   Следовательно, фенотип Hp 2-2 связан со сниженной способностью связываться с Hb, сниженным клиренсом комплексов Hp 2-2 Hb, нарушением противовоспалительного сигнального пути, повышенным окислением ЛПНП, что делает ЛПВП-холестерол неэффективным и менее эффективным в блокировании переноса гема. от Hb до Hp 1-1, что приводит к более высокому сердечно-сосудистому риску. У пациентов с диабетом, у которых также затронуты некоторые из этих путей, синергетический эффект гипергликемии и фенотипа гаптоглобина усугубляется, что приводит к более высокому риску.

   В лонгитюдных исследованиях, проведенных в других популяциях, было замечено, что генотип Hp 2-2 связан с 2-5-кратным увеличением риска сердечно-сосудистых заболеваний у лиц с СД. В частности, в исследовании сильного сердца отношение шансов наличия ССЗ при СД с фенотипом Hp 2-2 было в 2-5 раз больше, чем при СД с фенотипом Hp 2-1 (p=0,002). В мюнхенском исследовании Stent последовательная серия из 935 пациентов с диабетом, получавших лечение, наблюдалась в течение одного года после стентирования по поводу серьезных неблагоприятных сердечных событий. В этом исследовании было показано, что фенотип гаптоглобина 2-2 является независимым предиктором серьезных неблагоприятных сердечных событий. Кроме того, было замечено, что витамин Е оказывает существенное положительное влияние на сердечно-сосудистую систему у пациентов с СД Hp 2-2 в одной популяции (ИССЛЕДОВАНИЕ Израиль-ICARE), а постфактум анализ WHS (исследование здоровья женщин) и исследования HOPE, чтобы увидеть, влияет ли витамин Добавление E в подгруппу пациентов с фенотипом гаптоглобина 2-2, влияющим на смертность, показало незначительное снижение общей смертности. Это не получило широкого распространения, поскольку необходимы более крупные испытания и на нескольких популяциях, чтобы подтвердить связь и преимущества.

   Hp фенотип и этническая принадлежность

   В местном исследовании, проведенном в Сингапуре, было замечено, что частота генов Hp различается у разных этнических групп следующим образом: китайский Hp1: 0,330; Hp2: 0,670; Hp0: 0,029; Малайцы:Hp1:0,298;Hp2:0,702 ;Hp0:0,004; Индейцы Hp1: 0,167; Hp2: 0,833; Hp0: 0,009. Было замечено, что распределение частот Hp находится в равновесии Харди-Вайнберга в нашей популяции, поэтому ожидаемая распространенность Hp 2-2 составляет около 30-40%. Фенотипы Hp будут определяться с помощью анализа TaqMan в исследовательской лаборатории TTSH.

   1.2 Генотипы гаптоглобина и эндотелиальная функция

   Эндотелиальная дисфункция привлекает все большее внимание как потенциальный фактор патогенеза сосудистых заболеваний при СД. При СД2 нарушается естественный тонкий баланс в высвобождении факторов сокращения и расслабления эндотелием, что способствует дальнейшему повреждению сосудов и органов-мишеней. Было постулировано, что нарушение эндотелиальной функции обеспечивает окончательный общий путь, по которому множественные факторы риска оказывают вредное воздействие на сердечно-сосудистое здоровье, и было установлено в качестве мощного суррогатного маркера сердечно-сосудистого риска, при этом одно исследование показало даже лучшую предсказуемость, чем шкала риска Framingham. Устройство EndoPAT 2000 будет использоваться, поскольку оно предназначено для оценки функции эндотелия неинвазивным способом.

   Прямых исследований связи генотипов Hp с функцией эндотелия не проводилось, в одном пилотном исследовании, в котором функцию эндотелия оценивали с помощью постишемической реактивной гиперемии и тензометрической плетизмографии и выражали как максимальный поток после периода ишемии, что пациенты с Hp 2-2 с диабетом имели худшую эндотелиальную функцию по сравнению с пациентами без Hp 2-2 (450 +-50 против 600 +-40).

   1.3 Генотипы гаптоглобина и CIMT (толщина интимы медии сонной артерии)

   В исследовании Diabetes Heart генетический анализ генотипов Hp показал связь между генотипом Hp 2-2 и толщиной интимы медии сонных артерий (CIMT). Эти измерения будут проводиться, когда субъект лежит, его голова вытянута и слегка повернута в сторону, противоположную исследуемой сонной артерии, в соответствии с рекомендациями консенсуса Мангеймского CIMT. Два исследователя оценили CIMT у 23 человек, и был построен график Бланда-Альтмана. и пределы межпользовательского соглашения оказались в пределах от -0,1 до +0,1.

   1.4 Генотипы гаптоглобина и жесткость аортальной артерии

   Хотя прямых исследований, сравнивающих генотипы Hp и жесткость аортальной артерии, не проводилось, было проведено одно исследование, в котором они оценивали артериальную эластичность крупных и мелких артерий с использованием метода анализа контура пульсовой волны. Индекс эластичности крупных артерий был ниже у пациентов с Hp 2-2 по сравнению с Hp 1-1 (8,4 ± 2,3 мл/мм рт. ст. против 12,6 ± 4,1 мл/мм рт. ст. x 100; p

   Повышенная жесткость сосудов наблюдалась на ранних стадиях сахарного диабета 2 типа с использованием устройства сфигмокор. Вероятно, эта жесткость связана с эндотелиальной дисфункцией, а не со структурными сосудистыми изменениями, что, в свою очередь, предполагает, что она обратима. Также было замечено, что скорость пульсовой волны аорты (PWV), мера растяжимости аорты, предсказывает смертность у пациентов с диабетом независимо от известных смешанных факторов. Будет использоваться устройство SphygmoCor Xcel для оценки жесткости аортальной артерии с использованием скорости пульсовой волны от сонной до бедренной и центрального аортального давления. Перед началом исследования исследователи оценят скорость пульсовой волны у 20 человек, чтобы установить пределы согласия, используя график Бланда-Альтмана.

   1.5 Генотипы гаптоглобина и сосудистые маркеры

   Молекула адгезии сосудистых клеток-1 (VCAM-1) и молекула межклеточной адгезии-1 (ICAM-1) представляют собой белки, экспрессируемые на поверхности активированных эндотелиальных клеток (ЭК) и экспрессируемые при раннем атеросклерозе. Эти маркеры были оценены и признаны хорошими маркерами эндотелиальной дисфункции, поскольку часть белка выделяется в кровоток и может быть обнаружена в периферической плазме.

   1.6 Генотипы гаптоглобина и фенотипирование липидов плазмы

   Фенотип Hp 2-2 был связан с более высокими концентрациями окисленных ЛПНП, что в первую очередь связано с атеросклерозом. Также известно, что концентрации Apo-A1 HDL выше в этой группе пациентов. Фенотип Hp 2-2 также может быть связан с более высокими концентрациями Lp(a), что повышает риск сердечно-сосудистых заболеваний у этих пациентов. Будет проведено подробное фенотипирование липидов плазмы с использованием протеомики для поиска новых ассоциаций.

   1.7 Генотипы гаптоглобина и окислительный стресс

   Известно, что генотип Hp 2-2 вызывает более высокий окислительный стресс в эндотелии. Общий окислительный потенциал будет рассчитываться как Окислительный-ИНДЕКС. Для расчета этого индекса будут проведены два следующих теста. Этот индекс был установлен как хорошая оценка общего окислительного стресса.

   1. Тест d-ROM: этот тест будет проводиться на образцах сыворотки с использованием автоматизированного метода d-ROM. (Вассаль К., Пратали Л., Бони К., Меркури А., Ндреу Р. Оценка окислительного стресса как комбинированная мера прооксидантных и антиоксидантных аналогов у пациентов с ишемической болезнью сердца. Клин Биохим 2008;41:1162-7)
   2. FRAP (железовосстанавливающая способность плазмы — мера способности плазмы предотвращать повреждение сосудов) и d-ROMs (производные реактивных метаболитов кислорода) будут использоваться для расчета оценки окислительного стресса.

   Также будут измеряться другие маркеры окислительного стресса, такие как глиоксаль, метилглиоксаль, асимметричный диметиларгинин и гомоаргинин.

   1.8 Генотипы гаптоглобина и артериовенозный индекс сетчатки

   Наличие аномалий микрососудов сетчатки, особенно сужения артерий и дилатации вен, было связано с повышенным сердечно-сосудистым риском и было связано с эндотелиальной дисфункцией и воспалением. В настоящее время нет исследований, изучающих взаимосвязь между генотипами Hp и артериовенозным (АВ) индексом сетчатки. . Перед исследованиями будут закапывать глазные капли для расширения зрачков для осмотра глазного дна и для смазывания роговицы. В офтальмологической клинике участникам будет сделана визуализация сетчатки. Если пациенты не желают участвовать в визуализации сетчатки, они могут отказаться от теста визуализации сетчатки.

   2.0 Витамин Е, фенотип гаптоглобина и снижение сердечно-сосудистого риска

   В то время как функциональные различия между аллельными белковыми продуктами Hp1 и Hp2, особенно при СД, могут объяснить различия в восприимчивости к осложнениям у людей с Hp 2-2 по сравнению с людьми без Hp 2-2, основная причина уникального преимущества витамина Е заключается в том, что окислительно-восстановительный активный Hb связан с ЛПВП только у лиц с Hp 2-2 DM. У пациентов с СД снижение комплексов Hp-Hb приводит к увеличению связывания Hp-Hb с Apo-A1 на липопротеинах высокой плотности (ЛПВП), тем самым привязывая прооксидантную часть гема к ЛПВП. ЛПВП у лиц с СД Hp 2-2 лишены способности стимулировать обратный перенос холестерина из макрофагов. Помимо этого, фенотип Hp 2-2 связан с повышенным окислительным стрессом из-за недостаточного клиренса свободных радикалов и повышенного перекисного окисления ЛПНП.

   Витамин Е является мощным антиоксидантом с противовоспалительными свойствами. Он значительно облегчает состояние окислительного стресса благодаря своим мощным свойствам по удалению свободных радикалов и прямому и сильному взаимодействию с антиоксидантными ферментами. Добавка витамина Е на людях и животных снижает перекисное окисление липидов, выработку супероксида и снижает экспрессию рецепторов-мусорщиков (SR-A и CD36), которые особенно важны для образования пенистых клеток. Хотя не было доказано, что витамин Е полезен для снижения сердечно-сосудистого риска в общей популяции, он был полезен у пациентов с фенотипом Hp 2-2 с СД, оба состояния значительно увеличивают окислительный стресс в исследованиях, проведенных в одной популяции.

   Было проведено всего три интервенционных рандомизированных контролируемых исследования (РКИ), в которых единственным антиоксидантом, который получали участники СД, был витамин Е, и в которых определялся Hp-тип участников исследования. Исследование ICARE было единственным РКИ, направленным на оценку витамина Е у пациентов с СД, для которых был проспективно собран генотип Hp. В этом исследовании 1434 человека с СД > или = 55 лет с фенотипом Hp 2-2 были рандомизированы для приема витамина Е (400 МЕ/день/плацебо). Первичный комбинированный результат был значительно снижен у лиц, получавших витамин Е (2,2%), по сравнению с плацебо (4,7%, p = 0,001) через 18 месяцев после начала исследования, когда оно было прекращено. Кроме того, образцы крови от подгруппы пациентов, набранных для исследований WHS и HOPE, были проанализированы на полиморфизм Hp, и результаты были повторно оценены в соответствии с типом Hp пациента. Во всех этих исследованиях более высокий риск сердечно-сосудистых заболеваний наблюдался у лиц с Hp 2-2, и в этой группе наблюдалась польза от добавок витамина Е.

   2.1 Обоснование дозы и продолжительности приема витамина Е (альфа-токоферол).

   Мы будем использовать витамин Е 400 МЕ в день и соответствующее плацебо. Мы задействуем компанию Beacons, которая подготовит капсулы витамина Е (400 МЕ) и соответствующие капсулы плацебо. Препаратом витамина Е будет натуральный токоферол, который встречается в RRR-конфигурации. Мы будем давать витамин Е 400 МЕ в течение 6 месяцев, так как в большинстве исследований с использованием суррогатных маркеров сердечно-сосудистого риска наблюдалось улучшение через 6 месяцев после приема добавки. Более того, в упомянутом выше исследовании ICARE улучшение сердечно-сосудистых исходов наблюдалось через 18 месяцев, что позволяет предположить, что 6 месяцев должно быть достаточно, чтобы увидеть улучшение суррогатных маркеров сердечно-сосудистого риска.

   Восемь форм витамина Е делятся на две группы; четыре - токоферолы и четыре - токотриенолы. Они обозначаются префиксами альфа- (α-), бета- (β-), гамма- (γ-) и дельта- (δ-). Альфа-токоферол является наиболее распространенной формой в природе, которая, как известно, обладает наивысшей биологической активностью на основе анализов прививки плода и устраняет симптомы дефицита витамина Е у людей. Природные токоферолы встречаются только в RRR-конфигурации. Синтетическая форма содержит восемь различных стереоизомеров и называется «all-rac»-α-токоферол.

   Витамин Е содержится в натуральной форме в растительных маслах (зародышей пшеницы, подсолнечника, сафлора, кукурузном и соевом маслах), орехах (миндаль, арахис и фундук), семенах (семена подсолнечника), зеленых листовых овощах (шпинат и брокколи) и витаминизированных сухие завтраки, фруктовые соки, маргарин и спреды. Рекомендуемое потребление Института медицины для отдельных лиц составляет около 15 мг/день. Самый высокий безопасный уровень добавок витамина Е для взрослых составляет 1500 МЕ/день для натуральных форм витамина Е и 1000 МЕ/день для искусственных (синтетических) форм. Доступные популярные добавки с витамином Е включают D-альфа-токоферол, который получают из натуральных масел. Имеющиеся в продаже добавки с витамином Е обычно содержат только альфа-токоферол, либо неэтерифицированный, либо в виде сложного эфира ацетата, сукцината или никотината. У людей свободный и этерифицированный альфа-токоферол имеют одинаковую биодоступность. Добавки могут содержать либо натуральный RRR-, либо синтетический (all-rac) альфа-токоферол. Биологическая активность природного RRR-альфа-токоферола выше, чем у синтетического all-rac-альфа-токоферола и других природных форм витамина Е.

   Как окислительный стресс, так и индивидуальный генетический состав способствуют гомеостазу витамина Е у людей, и это может быть причиной различных клинических эффектов, наблюдаемых при улучшении клинических показателей в клинических испытаниях. Витамин Е всасывается в кишечнике, поступает в кровоток через лимфатическую систему, где всасывается вместе с липидами, упаковывается в хиломикроны и транспортируется в печень. После прохождения через печень в плазме преимущественно появляется только альфа-токоферол, а большинство других форм витамина Е предпочтительно метаболизируется и либо секретируется с желчью, либо не поглощается и не выделяется с фекалиями. В печени печеночный белок-переносчик альфа-токоферола (α-TTP) специфически разделяет α-форму с 2R-стереоизомерами. Плазменное включение RRR-α-токоферола является насыщаемым процессом. Уровни RRR-α-токоферола в плазме перестают увеличиваться примерно при 80 мкМ, несмотря на увеличение доз витамина Е до 1320 мг all-rac-α-токоферола в день. Вероятно, это связано с быстрым замещением циркулирующего α-токоферола вновь абсорбированным, и кинетический анализ показывает, что весь пул α-токоферола заменяется ежедневно. У людей предпочтительное накопление α-токоферола в организме зависит как от функционального α-ТТФ, так и от повышенного метаболизма и экскреции не-α-токоферолов. Белок-переносчик альфа-токоферола регулирует распределение и концентрацию витамина Е в организме, контролируя секрецию витамина Е печенью. Было замечено, что экспрессия гена белка-переносчика альфа-токоферола может быть индуцирована окислительным стрессом и гипоксией, агонистами ядерных рецепторов PPARα и RXR, а также повышением уровня цАМФ. Это опосредуется уже присутствующим фактором транскрипции, называемым фактором транскрипции, связывающим ответный элемент цАМФ (CREB). Однонуклеотидные полиморфизмы, часто встречающиеся у здоровых людей, резко влияют на активность промотора.

   В клинических испытаниях использовались различные дозы витамина Е от 400 МЕ до 2000 МЕ. Институт медицины США предлагает рекомендуемое потребление с пищей (RDA) 15-1000 мг/день (1 мг = 1,5 МЕ; 22,5-1500 МЕ/день). Мы используем дозу 400 МЕ в течение шести месяцев. Нет данных о побочных эффектах при приеме в пределах RDA, однако может быть геморрагическая токсичность в высоких дозах, особенно у пациентов, принимающих антикоагулянты. Следовательно, мы будем исключать пациентов, принимающих антикоагулянты.

   3.0 Статистические соображения

   3.1 Расчет размера выборки. Общий предполагаемый размер выборки для исследования составляет 300 пациентов. Требуемый размер выборки 100 для каждой страты фенотипа Hp фазы RCT основан на: 5% ошибка типа I; мощность 90%; предположение о том, что витамин Е, как ожидается, будет иметь как минимум умеренный эффект, представленный стандартизированной величиной эффекта (средняя разница/объединенная стандартная ошибка) 0,5 для каждого маркера риска; двухвыборочный t-критерий с одинаковой дисперсией; и 15% отсева. Предполагая 35% распространенность Hp 2-2 в нашей популяции, нам необходимо провести скрининг 300 пациентов, чтобы набрать 100 пациентов с фенотипом Hp 2-2.

   Предполагая среднюю разницу RHI в 0,25 единиц с соответствующим стандартным отклонением (SD) в 0,3, получаем стандартизированный размер эффекта 0,25/0,3. = 0,83 как минимальная разница в RHI, наблюдаемая в другом исследовании. Мы не делали поправку на множественное тестирование/сравнение из-за пилотного характера РКИ, а также из-за исследовательского характера исследования в целом.

   Размер выборки для исследования in vitro ограничен ограниченными ресурсами. Тем не менее, результаты моделирования, основанные на двустороннем критерии Уилкоксона со знаком-рангом, ошибка типа I 5%, корреляция между парами, равная 0,5, и 5000 выборок моделирования Монте-Карло показывают, что 20 пар обеспечивают достаточную мощность для обнаружения средних и больших стандартизированных размеров эффектов. (М1).

   Рандомизация будет осуществляться в электронном виде через Интернет — централизованный веб-сайт внутренней сети, защищенный паролем, чтобы обеспечить рандомизацию пациентов в тот момент, когда они подходят для участия в исследовании (строго последовательно). Блокированный график рандомизации будет использоваться в блоках по 10 для исследования на основе соотношения распределения 1:1. Затем специальный защищенный паролем сайт присвоит пациенту уникальный номер испытания, который будет соответствовать номерам лечения, указанным на коробках с лекарствами. После рандомизации пациенту вводят первую дозу.

   3.2 Обработка данных и статистический анализ: обработка данных Вся необходимая информация будет собираться с использованием соответствующих хорошо разработанных форм сбора данных исследования при каждом посещении и последующей оценке по телефону. Все данные исследования будут храниться в базе данных исследования, доступной только для персонала, занимающегося вводом данных и проверкой данных.

   План статистического анализа Данные по исходным демографическим и клиническим переменным, а также маркерам риска будут обобщены по фенотипам Hp и в целом, чтобы дать представление о потенциальных ассоциациях. Бинарные данные будут суммироваться с использованием частоты и пропорций. Критерий хи-квадрат и точный критерий Фишера будут использоваться для оценки соответствующих ассоциаций (включая преимущества витамина Е), и, при необходимости, будет использоваться логистическая регрессия для характеристики ассоциаций с поправкой на потенциальные искажающие факторы. Непрерывные переменные будут суммированы с использованием средних значений (стандартные отклонения) или медианы (диапазона), если это будет сочтено целесообразным. Два выборочных t-критерия или критерий Манна-Уитни будут использоваться для оценки соответствующих ассоциаций, а обобщенные линейные модели будут использоваться для характеристики ассоциаций с поправкой на потенциальные искажающие факторы. Рассматриваются обобщенные линейные модели, поскольку они могут при необходимости учитывать ненормальные (асимметричные) данные или логарифмически нормальные данные (например, лабораторные данные). Отдельные тесты и модели будут выполняться для каждого соответствующего результата.

   Данные исследования in vitro будут обобщены аналогично тому, как описано в предыдущем абзаце, по статусу фенотипа Hp 2-2 и концентрации витамина Е. Знаковый ранговый критерий Уилкоксона будет использоваться для оценки преимуществ витамина Е между группами фенотипа Hp по концентрациям. Тесты Манна-Уитни и Джонкхера-Терпстры будут использоваться для оценки соотношения концентрации и пользы витамина Е по группам фенотипов Hp. Обобщенные линейные смешанные модели будут использоваться для изучения различных тенденций и ассоциаций с учетом (i) соответствия пациентов с Hp 2-2 и без Hp 2-2, (ii) повторной оценки у пациента по концентрации витамина Е, (iii) корректировка потенциальных искажающих факторов и (iv) корректировка потенциальной ненормальности (асимметрии) данных с использованием других соответствующих распределений, таких как логарифмически нормальное или гамма-распределение. Будет проведен общий анализ данных исследования in vitro.

   Анализ Бленда-Альтмана будет использоваться для оценки пределов согласованности для исследований согласованности и надежности. Там, где это уместно, для оценки соответствующих коэффициентов надежности будет использоваться смешанный модельный подход.

   5.0 Клиническая значимость

   Если наблюдается связь между фенотипом Hp 2-2 и сердечно-сосудистым риском, эта группа пациентов может быть назначена для лечения витамином Е в дополнение к статинам и другим традиционным методам лечения для снижения сердечно-сосудистого риска. В будущем можно запланировать крупномасштабное общенациональное РКИ, чтобы увидеть, помогает ли лечение витамином Е снизить риск в этой группе пациентов. Проведение таких исследований среди многонационального населения является обязательным, поскольку оно дает представление о последовательности и обобщаемости ожидаемых преимуществ.