Beziehung des Haptoglobin-Phänotyps zur Gefäßfunktion und Reaktion auf Vitamin-E-Supplementierung bei Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2: Die EVAS-Studie (EVAS)

1.0 Hintergrund und klinische Bedeutung 1.1 Einführung Die Inzidenz von Diabetes Mellitus Typ 2 (DM2) nimmt weltweit und in Singapur rapide zu. Die Hauptursache für erhöhte Morbidität und Mortalität bei Patienten mit DM2 ist die Entwicklung von mikrovaskulären und makrovaskulären Komplikationen. Obwohl eine strenge glykämische Kontrolle nachweislich mikrovaskuläre Komplikationen reduziert, fehlen noch Beweise für makrovaskuläre Komplikationen. Akzelerierte Atherosklerose ist die Hauptursache für erhöhte Sterblichkeit und Morbidität bei diesen Patienten. Es ist von größter Bedeutung, neue Ziele zur Kontrolle der Atherosklerose bei Patienten mit DM2 zusätzlich zur konventionellen Behandlung zu bewerten. Es besteht ein ungedeckter Bedarf, neue Ziele oder Marker zu finden, die ein erhöhtes Risiko bei Patienten mit Diabetes mellitus vorhersagen, und wir müssen alternative Behandlungen zusätzlich zu herkömmlichen Zielen in Betracht ziehen, um das Risiko bei diesen Hochrisikopatienten zu reduzieren.

Patienten mit DM2 haben nicht nur ein erhöhtes Risiko für Atherosklerose, sie tragen auch ein größeres Ausmaß der Krankheitslast. Die endotheliale Dysfunktion wird als Kennzeichen der den Blutgefäßen zugefügten pathologischen Schädigung angesehen. Hyperglykämie beeinflusst mitochondriale, enzymatische und nicht-enzymatische Wege, die mit der Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) verbunden sind, was zu einer verringerten Bioverfügbarkeit von Stickstoffmonoxid und einer endothelialen Dysfunktion führt, die sich häufig durch eine verringerte Endothel-abhängige Vasodilatation und erhöhte Plasmaspiegel von Endothel-abgeleiteten regulatorischen Proteinen zeigt. Darüber hinaus haben DM2-Patienten die antioxidativen Abwehrkräfte in Form von niedrigen Spiegeln der antioxidativen Enzyme und des Alpha-Tocopherols (Vitamin E) beeinträchtigt, was eine angemessene Kompensation des Anstiegs des oxidativen Stresses verhindern kann. Eine weitere Rolle von oxidativem Stress bei der Vermittlung der Entwicklung von Arteriosklerose wurde auch in der oxidativen Hypothese gezeigt. In diesem Modell ist das prominenteste Ziel für die oxidative Modifikation das LDL-Molekül. Oxidiertes LDL wird vom LDL-Rezeptor nicht erkannt, wird jedoch leicht vom CD36-Scavenger-Rezeptor-Weg in Makrophagen aufgenommen, was zu einer nennenswerten Anhäufung von Cholesterylester und Bildung von Schaumzellen führt. Oxidiertes LDL ist entzündungsfördernd, es bewirkt eine Hemmung der endothelialen NO-Synthetase, fördert die Vasokonstriktion und Monozytenadhäsion und fördert die Blutplättchenaggregation und Thrombose.

HP-Phänotyp und oxidative Gewebeschädigung

Das Haptoglobin (Hp)-Protein ist aufgrund seiner Fähigkeit, die oxidative Aktivität von Hämoglobin (Hb) zu neutralisieren, ein Antioxidans. Beim Menschen ist Hp durch einen genetischen Polymorphismus mit drei strukturell unterschiedlichen Phänotypen (Hp1-1, Hp 2-1 und Hp 2-2) gekennzeichnet, die aus der Expression von zwei verschiedenen Allelen (Hp 1 und Hp 2) des Haptoglobin-Gens resultieren Chromosom 16q22. Das Proteinprodukt des Hp2-Allels ist ein minderwertiges Antioxidans im Vergleich zum Hp1-Allelprodukt. Hp 1-1 ist ein kleines Molekül (86 kDa) mit wohldefinierter Struktur, während Hp 2-1 durch Heteropolymere (86-300 kDa) gekennzeichnet ist und Hp 2-2 große makromolekulare Komplexe (170-1000 kDa) bildet.

Die Funktion von Hp besteht darin, aus roten Blutkörperchen freigesetztes freies Hb zu binden, das während des natürlichen Umsatzes von roten Blutkörperchen in das Blut freigesetzt wird. Freies Hb ist aufgrund seines Häm-Eisens in der Lage, erhebliche oxidative Gewebeschäden zu verursachen. Wann immer Hb jedoch in den Kreislauf freigesetzt wird, bindet es sofort mit extrem hoher Affinität an Hp, um einen Hp-Hb-Komplex zu bilden. Diese Bindung dient dazu, das oxidative Potential von Hb zu hemmen, indem die Freisetzung von Häm-Eisen aus Hb verhindert wird. Hp wird normalerweise im Blut in einem mehr als 400-fachen molaren Überschuss zu freiem Hb gefunden und daher ist Hp in der Lage, das gesamte Hb zu binden, das während des normalen Umsatzes roter Blutkörperchen freigesetzt wird. Sobald Hb an Hp gebunden ist, wird es über den CD163-Scavenger-Rezeptor, der auf Monozyten/Makrophagen exprimiert wird, schnell aus dem Blutstrom entfernt, jedoch sind Bildung und Clearance von Hp-Hb-Komplexen bei Hp 2-2-Phänotypen beeinträchtigt.

Von Hb abgeleitetes Eisen kann eine Reihe von oxidativen Reaktionen katalysieren, die durch Hp gehemmt werden können.

1. Eisen(II)-Hämeisen (Fe2+) kann mit Wasserstoffperoxid reagieren, um Eisen(III)-Hb (Fe3+) und die hochreaktiven Hydroxylradikalspezies zu ergeben. Durch Abspaltung eines Wasserstoffatoms von mehrfach ungesättigten Fettsäuren können Hydroxylradikale den Prozess der Lipidperoxidation initiieren.
2. Eisen-Hb (Fe2+) kann auch mit Wasserstoffperoxid reagieren, um Ferryl-Hb (Fe4+) zu erzeugen, ein äußerst instabiles Molekül, das leicht mit einem zweiten Molekül Wasserstoffperoxid reagiert, um Eisen-Hb (Fe3+) und ein Superoxid-Anion zu ergeben. Die schädlichen Wirkungen des Superoxidanions sind zweifach: Reduktion von Eisen(III) (Fe3+) in Hb zu Eisen(II)(II+), was die Produktion zusätzlicher Hydroxylradikale ermöglicht, wie in Reaktion 1 beschrieben, und Dismutation des Superoxidanions zur Produktion von Wasserstoffperoxid , was wiederum die Produktion von ROS fördert.

3. Eisen-Hb (enthält Fe3+), auch als Methämoglobin bekannt, kann seine Häm-Einheit spontan übertragen, was zum Eintritt von Häm in verschiedene lipophile Umgebungen wie LDL oder Zellmembranen führt. Sobald Häm-Eisen in seine neue Lipidumgebung interkaliert ist, kann es Reaktionen mit Wasserstoffperoxid wie oben beschrieben oder mit benachbarten Lipidperoxiden eingehen, die eine Kaskade freier Radikale erzeugen und zu einer ausgedehnten Lipidoxidation führen.

   Als Teil des Hp-Hb-Komplexes stabilisiert Hp Häm in der Häm-Tasche von Hb und verhindert, dass Hb oxidative Schäden verursacht. Das Ausmaß, in dem Hp die Redoxaktivität von Häm-Eisen neutralisiert, unterscheidet sich jedoch zwischen den Hp-Typen. Dies wurde in einer Reihe von Systemen sowohl in vitro als auch in vivo gezeigt. Zum Beispiel zeigten Studien unter Verwendung von Linolensäure, dass Hp 1-1 die Oxidation (Dienbildung) verhinderte, gemessen durch eine Zunahme der Extinktion bei 232 nm, in größerem Ausmaß als Hp 2-2 . Eine andere Studie untersuchte die LDL-Oxidation aufgrund des Hämtransfers von Hb zu LDL. Der Häm-Transfer wurde durch Löschen des von dansyliertem LDL emittierten Fluoreszenzsignals gemessen. Es wurde festgestellt, dass Hp 1-1 im Vergleich zu Hp 2-2 bei der Verhinderung des Häm-Transfers von Hb überlegen war.

   Hp-Phänotypen und kardiovaskuläre Risikostudien haben gezeigt, dass Hp 2-2 Hb-Komplexe ebenfalls weniger effizient ausgeschieden werden als Nicht-Hp 2-2 Hb-Komplexe. Bei DM2-Patienten ist dieses Phänomen aufgrund der Herunterregulierung von CD163 ausgeprägter, insbesondere bei Hp 2-2-Personen. Eine Beeinträchtigung der entzündungshemmenden Makrophagen-Signalgebung über eine CD163/pAkt/IL-10-Achse wird auch bei Hp 2-2-Patienten beobachtet.

   Eine Hp-Hb-defiziente Clearance bei Hp 2-2 DM2-Individuen führt zu einer erhöhten Hp-Hb-Bindung an Apo A1 auf Lipoprotein hoher Dichte (HDL-C), wodurch die prooxidative Häm-Einheit an HDL gebunden wird. Dies macht es in seiner Fähigkeit unzulänglich, Cholesterin von Makrophagen umzukehren.

   Das Hp 2-2-Protein ist im Vergleich zu Hp 1-1 bei der Blockierung des Häm-Transfers von Hb weniger effizient. Darüber hinaus kann die Zunahme des Häm-Transfers, wenn Hb glykosyliert ist, eine mechanistische Erklärung für die bei Hp 2-2 DM2 beobachtete Zunahme von kardiovaskulären Erkrankungen liefern.

   Daher ist der Hp 2-2-Phänotyp mit einer verringerten Fähigkeit zur Bindung an Hb, einer verringerten Clearance von Hp 2-2-Hb-Komplexen, einer Beeinträchtigung des entzündungshemmenden Signalwegs, einer erhöhten LDL-Oxidation, einer Ineffizienz von HDL-Cholesterin und einer weniger effizienten Blockierung des Hämtransfers verbunden von Hb bis Hp 1-1, die alle zu einem höheren kardiovaskulären Risiko führen. Bei Diabetespatienten, bei denen einige dieser Signalwege ebenfalls betroffen sind, wird der synergetische Effekt von Hyperglykämie und Haptoglobin-Phänotyp verstärkt, was zu einem höheren Risiko führt.

   In Längsschnittstudien, die in anderen Bevölkerungsgruppen durchgeführt wurden, wurde festgestellt, dass der Hp 2-2-Genotyp mit einem 2- bis 5-fach erhöhten Risiko für das Auftreten von CVD bei Personen mit DM verbunden ist. Insbesondere in der Strong-Heart-Studie war das Odds Ratio, CVD bei DM mit dem Phänotyp Hp 2-2 zu haben, 2-5 mal höher als bei DM mit dem Phänotyp Hp 2-1 (p = 0,002). In der Münchener Stent-Studie wurde eine aufeinanderfolgende Serie von 935 behandelten Diabetikern ein Jahr lang nach Stent-Implantation auf schwerwiegende unerwünschte kardiale Ereignisse nachbeobachtet. In dieser Studie wurde der Haptoglobin-2-2-Phänotyp als unabhängiger Prädiktor für schwerwiegende unerwünschte kardiale Ereignisse angesehen. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass Vitamin E Hp 2-2 DM-Patienten in einer Population einen erheblichen kardiovaskulären Nutzen bietet (Israel-ICARE-STUDIE) und Post-hoc-Analysen der WHS- (Frauengesundheitsstudie) und der HOPE-Studie, um festzustellen, ob Vitamin E-Supplementierung in der Untergruppe von Patienten mit Haptoglobin 2-2-Phänotyp beeinflusste die Mortalität zeigte eine nicht signifikante Verringerung der Gesamtmortalität. Dies wurde nicht weithin angenommen, da größere Studien und an mehreren Populationen erforderlich sind, um die Assoziation und den Nutzen zu untermauern.

   HP-Phänotyp und Ethnizität

   In einer in Singapur durchgeführten lokalen Studie wurde festgestellt, dass die Häufigkeit der Hp-Gene in den verschiedenen Ethnien wie folgt variiert: Chinesisch Hp1:0,330;Hp2:0,670;Hp0: 0,029; Malaysier:Hp1:0,298;Hp2:0,702 ;Hp0:0.004; Indianer Hp1: 0,167;Hp2:0,833;Hp0:0,009. Es wurde festgestellt, dass die Verteilung der Hp-Frequenzen in unserer Bevölkerung im Hardy-Weinberg-Gleichgewicht liegt, daher liegt die erwartete Prävalenz von Hp 2-2 bei etwa 30-40 %. Die Hp-Phänotypen werden durch TaqMan-Analyse im TTSH-Forschungslabor bestimmt.

   1.2 Haptoglobin-Genotypen und Endothelfunktion

   Die endotheliale Dysfunktion hat zunehmende Aufmerksamkeit als potenzieller Beitrag zur Pathogenese von Gefäßerkrankungen bei DM erhalten. Bei DM2 wird das natürliche empfindliche Gleichgewicht bei der Freisetzung von kontrahierenden und entspannenden Faktoren durch das Endothel verändert, was zu weiteren Gefäß- und Endorganschäden beiträgt. Es wurde postuliert, dass eine beeinträchtigte Endothelfunktion einen letzten gemeinsamen Weg bereitstellt, über den mehrere Risikofaktoren ihre schädlichen Auswirkungen auf die kardiovaskuläre Gesundheit ausüben, und wurde als starker Ersatzmarker für kardiovaskuläres Risiko etabliert, wobei eine Studie eine sogar bessere Vorhersagbarkeit als der Framingham-Risiko-Score zeigte. Das EndoPAT 2000-Gerät wird verwendet, da dieses für die nicht-invasive Bestimmung der Endothelfunktion etabliert wurde.

   Es wurden keine direkten Studien durchgeführt, um eine Assoziation von Hp-Genotypen mit der Endothelfunktion zu untersuchen. In einer Pilotstudie, in der die Endothelfunktion unter Verwendung von postischämischer reaktiver Hyperämie und Dehnungsmessstreifen-Plethysmographie bewertet und als maximaler Fluss nach einer ischämischen Periode ausgedrückt wurde, wurde dies beobachtet dass Hp-2-2-Patienten mit Diabetes eine schlechtere Endothelfunktion im Vergleich zu Nicht-Hp-2-2-Patienten aufwiesen (450 +-50 gegenüber 600+-40).

   1.3 Haptoglobin-Genotypen und CIMT (Carotis Intima Media Thickness)

   In der Diabetes Heart-Studie zeigten genetische Analysen von Hp-Genotypen eine Assoziation zwischen dem Hp 2-2-Genotyp und der Carotis-Intima-Media-Dicke (CIMT). Diese Messungen werden bei liegendem Probanden durchgeführt, wobei der Kopf ausgestreckt und leicht gegenüber der untersuchten Halsschlagader gedreht ist, gemäß den Empfehlungen des Mannheimer CIMT-Konsenses. Zwei Forscher haben die CIMT bei 23 Personen geschätzt und ein Bland-Altman-Plot wurde gezeichnet und es wurde festgestellt, dass die Grenzen der Vereinbarung zwischen Benutzern innerhalb von -0,1 bis +0,1 liegen.

   1.4 Haptoglobin-Genotypen und Steifigkeit der Aortenarterie

   Obwohl es keine direkten Studien zum Vergleich von Hp-Genotypen und der Aortenarteriensteifigkeit gibt, wurde eine Studie durchgeführt, in der die arterielle Elastizität großer und kleiner Arterien unter Verwendung der Pulswellenkonturanalysemethode bewertet wurde. Der Elastizitätsindex der großen Arterie war niedriger bei Patienten mit Hp 2-2 im Vergleich zu Hp 1-1 (8,4 +-2,3 ml/mmHg versus 12,6 +-4,1 ml/mmHg x 100; p

   Erhöhte Gefäßsteifigkeit wurde früh im Verlauf von Diabetes Mellitus Typ 2 unter Verwendung eines Sphygmocor-Geräts beobachtet. Es ist wahrscheinlich, dass diese Steifheit eher mit einer endothelialen Dysfunktion als mit strukturellen vaskulären Veränderungen zusammenhängt – dies legt wiederum nahe, dass sie reversibel ist. Es wurde auch beobachtet, dass die Aortenpulswellengeschwindigkeit (PWV), ein Maß für die Dehnbarkeit der Aorta, die Mortalität bei Patienten mit Diabetes unabhängig von bekannten Störfaktoren vorhersagt. Das SphygmoCor Xcel-Gerät wird verwendet, um die Aortenarteriensteifigkeit unter Verwendung der Pulswellengeschwindigkeit von Karotis zu Femur und des zentralen Aortendrucks abzuschätzen. Die Forscher schätzen die Pulswellengeschwindigkeit bei 20 Personen, um die Übereinstimmungsgrenzen unter Verwendung des Bland-Altman-Diagramms vor Beginn der Studie festzulegen.

   1.5 Haptoglobin-Genotypen und Gefäßmarker

   Gefäßzelladhäsionsmolekül-1 (VCAM-1) und interzelluläres Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1) sind Proteine, die auf der Oberfläche von aktivierten Endothelzellen (ECs) exprimiert werden und in der frühen Atherosklerose exprimiert werden. Diese Marker wurden evaluiert und als gute Marker für endotheliale Dysfunktion angesehen, da ein Teil des Proteins in die Zirkulation abgegeben wird und im peripheren Plasma nachgewiesen werden kann.

   1.6 Haptoglobin-Genotypen und Phänotypisierung von Plasmalipiden

   Der Phänotyp Hp 2-2 wurde mit höheren oxidierten LDL-Konzentrationen in Verbindung gebracht, die hauptsächlich an Arteriosklerose beteiligt sind. Es ist auch bekannt, dass die Konzentrationen von Apo-A1-HDL in dieser Patientengruppe höher sind. Der Phänotyp Hp 2-2 kann auch mit höheren Lp(a)-Konzentrationen assoziiert sein, was diese Patienten einem höheren kardiovaskulären Risiko aussetzt. Es wird eine detaillierte Phänotypisierung von Plasmalipiden unter Verwendung von Proteomik durchgeführt, um nach neuen Assoziationen zu suchen.

   1.7 Haptoglobin-Genotypen und oxidativer Stress

   Es ist bekannt, dass der Genotyp Hp 2-2 dem Endothel einen höheren oxidativen Stress verleiht. Das gesamte Oxidationspotential wird als Oxidations-INDEX berechnet. Zwei Tests werden wie folgt durchgeführt, um diesen Index zu berechnen. Dieser Index hat sich als guter Schätzwert für den gesamten oxidativen Stress etabliert.

   1. d-ROMs-Test: Dieser Test wird an Serumproben unter Verwendung der automatisierten d-ROMs-Methode durchgeführt. (C. Vassalle, L. Pratali, C. Boni, A. Mercuri, R. Ndreu. Ein oxidativer Stress-Score als kombiniertes Maß der prooxidativen und antioxidativen Gegenstücke bei Patienten mit koronarer Herzkrankheit. Clin Biochem 2008;41:1162-7)
   2. FRAP (Ferric Reduction Capability of Plasma – ein Maß für die Fähigkeit des Plasmas, Schäden an Gefäßen zu verhindern) und d-ROMs (Derivate für die Reactive Oxygen Metabolites)-Tests werden zur Berechnung des oxidativen Stress-Scores verwendet.

   Andere Marker für oxidativen Stress werden ebenfalls gemessen, wie Glyoxal, Methylglyoxal, asymmetrisches Dimethylarginin und Homoarginin.

   1.8 Haptoglobin-Genotypen und retinaler arteriovenöser Index

   Das Vorhandensein mikrovaskulärer Anomalien der Netzhaut, insbesondere Arterienverengung und Venenerweiterung, wurde mit einem erhöhten kardiovaskulären Risiko in Verbindung gebracht und mit endothelialer Dysfunktion und Entzündung in Verbindung gebracht. Gegenwärtig gibt es keine Studien, die sich mit der Beziehung zwischen Hp-Genotypen und dem retinalen arteriovenösen (AV) Index befassen. . Vor den Untersuchungen werden Augentropfen eingeträufelt, um die Pupillen für die Augenhintergrunduntersuchung zu erweitern und die Hornhaut zu benetzen. Für die Probanden in der Augenklinik wird eine Netzhautbildgebung durchgeführt. Wenn Patienten nicht an der Netzhautbildgebung teilnehmen möchten, können sie sich gegen den Netzhautbildgebungstest entscheiden.

   2.0 Vitamin E, Haptoglobin-Phänotyp und Verringerung des kardiovaskulären Risikos

   Während funktionelle Unterschiede zwischen allelischen Hp1- und Hp2-Proteinprodukten, insbesondere bei DM, die Unterschiede in der Anfälligkeit für Komplikationen bei Hp 2-2-Personen und Nicht-Hp 2-2-Personen erklären können, ist der Hauptgrund für den einzigartigen Nutzen von Vitamin E das redoxaktive Hb ist nur bei Hp 2-2 DM-Individuen mit HDL assoziiert. Bei Patienten mit DM führen verringerte Hp-Hb-Komplexe zu einer erhöhten Hp-Hb-Bindung an Apo-A1 auf High-Density-Lipoprotein (HDL), wodurch die prooxidative Häm-Einheit an HDL gebunden wird. HDL in Hp 2-2 DM-Individuen ist in seiner Fähigkeit, den Rücktransfer von Cholesterin aus Makrophagen zu stimulieren, mangelhaft. Außerdem ist der Hp-Phänotyp 2-2 mit erhöhtem oxidativem Stress aufgrund mangelhafter Beseitigung freier Radikale und erhöhter LDL-Peroxidation verbunden.

   Vitamin E ist ein starkes Antioxidans mit entzündungshemmenden Eigenschaften. Es lindert den Zustand von oxidativem Stress sowohl durch seine starken Radikalfängereigenschaften als auch durch die direkte und starke Wechselwirkung mit den antioxidativen Enzymen. Vitamin E-Supplementierung bei Menschen und Tiermodellen hat gezeigt, dass sie die Lipidperoxidation, die Superoxidproduktion und die Expression von Scavenger-Rezeptoren (SR-A und CD36) verringert, die bei der Bildung von Schaumzellen besonders wichtig sind. Obwohl sich Vitamin E bei der Verringerung des kardiovaskulären Risikos in der Allgemeinbevölkerung nicht als nützlich erwiesen hat, war es bei Patienten mit Hp 2-2-Phänotyp mit DM nützlich, beides Zustände, die den oxidativen Stress in Studien, die an einer Population durchgeführt wurden, erheblich erhöhen.

   Es gab nur drei interventionelle randomisierte kontrollierte Studien (RCTs), in denen das einzige Antioxidans, das die DM-Teilnehmer erhielten, Vitamin E war und in denen der Hp-Typ der Studienteilnehmer bestimmt wurde. Die ICARE-Studie war die einzige RCT, die darauf abzielte, Vitamin E bei DM-Patienten zu bewerten, für die der Hp-Genotyp prospektiv erhoben wurde. In dieser Studie wurden 1.434 DM-Personen im Alter von > oder = 55 Jahren mit dem Phänotyp Hp 2-2 randomisiert Vitamin E (400 IE/Tag/Placebo) zugeteilt. Der primäre kombinierte Endpunkt war bei Personen, die Vitamin E erhielten (2,2 %), im Vergleich zu Placebo (4,7 %, p = 0,001) 18 Monate nach Beginn der Studie, als sie beendet wurde, signifikant reduziert. Zusätzlich wurden Blutproben von einer Untergruppe von Patienten, die für die WHS- und HOPE-Studien rekrutiert wurden, auf Hp-Polymorphismus analysiert und die Ergebnisse entsprechend dem Hp-Typ des Patienten neu bewertet. In all diesen Studien wurde bei Hp 2-2-Personen ein höheres Risiko für kardiovaskuläre Ereignisse festgestellt, und in dieser Gruppe wurde ein Nutzen einer Vitamin-E-Supplementierung festgestellt.

   2.1 Begründung für Dosis und Dauer von Vitamin E (Alpha-Tocopherol).

   Wir werden Vitamin E 400 IE pro Tag und ein passendes Placebo verwenden. Wir werden die Firma Beacons beauftragen, die die Vitamin-E-Kapseln (400 IE) und die passenden Placebo-Kapseln herstellt. Vitamin E-Präparat wird das natürliche Tocopherol sein, das in der RRR-Konfiguration vorkommt. Wir werden 6 Monate lang 400 IE Vitamin E geben, da die meisten Studien, die Ersatzmarker für das kardiovaskuläre Risiko verwenden, eine Verbesserung innerhalb von 6 Monaten nach der Supplementierung festgestellt haben. Darüber hinaus wurde in der oben erwähnten ICARE-Studie eine Verbesserung des kardiovaskulären Outcomes nach 18 Monaten beobachtet, was darauf hindeutet, dass 6 Monate eine angemessene Dauer sein sollten, um eine Verbesserung der Surrogatmarker des kardiovaskulären Risikos zu sehen.

   Die acht Formen von Vitamin E werden in zwei Gruppen eingeteilt; vier sind Tocopherole und vier sind Tocotrienole. Sie werden durch die Präfixe alpha- (α-), beta- (β-), gamma- (γ-) und delta- (δ-) identifiziert. Alpha-Tocopherol ist die in der Natur am häufigsten vorkommende Form, von der bekannt ist, dass sie die höchste biologische Aktivität aufweist, basierend auf fötalen Resorptionstests, und die Symptome eines Vitamin-E-Mangels beim Menschen umkehrt. Natürliche Tocopherole kommen nur in der RRR-Konfiguration vor. Die synthetische Form enthält acht verschiedene Stereoisomere und heißt „all-rac“-α-Tocopherol.

   Vitamin E kommt in seiner natürlichen Form in Pflanzenölen (Weizenkeim-, Sonnenblumen-, Distel-, Mais- und Sojabohnenöl), Nüssen (Mandeln, Erdnüssen und Haselnüssen), Samen (Sonnenblumenkernen), grünem Blattgemüse (Spinat und Brokkoli) und angereicherten vor Frühstückszerealien, Fruchtsäfte, Margarine und Brotaufstriche. Die vom Institute of Medicine empfohlene Zufuhr für Einzelpersonen liegt bei etwa 15 mg/Tag. Die höchste sichere Menge an Vitamin-E-Ergänzungen für Erwachsene beträgt 1.500 IE/Tag für natürliche Formen von Vitamin E und 1.000 IE/Tag für die künstliche (synthetische) Form. Zu den beliebten erhältlichen Vitamin-E-Ergänzungen gehört D-Alpha-Tocopherol, das aus natürlichen Ölen gewonnen wird. Kommerziell erhältliche Vitamin-E-Ergänzungen enthalten normalerweise nur alpha-Tocopherol, das entweder unverestert oder als Ester von Acetat, Succinat oder Nicotinat bereitgestellt wird. Beim Menschen haben freies und verestertes Alpha-Tocopherol die gleiche Bioverfügbarkeit. Nahrungsergänzungsmittel können entweder das natürliche RRR- oder das synthetische (all-rac) Alpha-Tocopherol enthalten. Die biologische Aktivität von natürlichem RRR-alpha-Tocopherol ist höher als die von synthetischem all-rac-alpha-Tocopherol und anderen natürlichen Formen von Vitamin E.

   Sowohl oxidativer Stress als auch die individuelle genetische Ausstattung tragen zur Vitamin-E-Homöostase beim Menschen bei, und dies kann für die variablen klinischen Wirkungen verantwortlich sein, die bei der Verbesserung klinischer Variablen in klinischen Studien beobachtet wurden. Vitamin E wird im Darm aufgenommen, gelangt über das Lymphsystem in den Kreislauf, wo es zusammen mit Lipiden aufgenommen, in Chylomikronen verpackt und zur Leber transportiert wird. Nach der Passage durch die Leber erscheint im Plasma bevorzugt nur alpha-Tocopherol, und die meisten anderen Formen von Vitamin E werden bevorzugt metabolisiert und entweder in die Galle ausgeschieden oder nicht aufgenommen und mit den Fäzes ausgeschieden. In der Leber sortiert das hepatische Alpha-Tocopherol-Transferprotein (α-TTP) spezifisch die α-Form mit den 2R-Stereoisomeren aus. Plasma-RRR-α-Tocopherol-Einbau ist ein sättigbarer Prozess. Die Plasmaspiegel von RRR-α-Tocopherol steigen bei etwa 80 μM nicht mehr an, trotz steigender Dosierungen der Vitamin-E-Supplementierung von bis zu 1.320 mg all-rac-α-Tocopherol pro Tag. Dies ist wahrscheinlich sekundär zum schnellen Ersatz des zirkulierenden durch neu absorbiertes α-Tocopherol und kinetische Analysen zeigen, dass der gesamte Pool an α-Tocopherol täglich ersetzt wird. Beim Menschen hängt die bevorzugte Akkumulation von α-Tocopherol im Körper sowohl von einem funktionellen α-TTP als auch von einem erhöhten Metabolismus und einer erhöhten Ausscheidung von Nicht-α-Tocopherolen ab. Das Alpha-Tocopherol-Transferprotein reguliert die Verteilung und Konzentration von Vitamin E im ganzen Körper, indem es die Sekretion von Vitamin E aus der Leber kontrolliert. Es wurde festgestellt, dass die Expression des alpha-Tocopherol-Transferprotein-Gens durch oxidativen Stress und Hypoxie, durch Agonisten der nukleären Rezeptoren PPARα und RXR und durch Erhöhung der cAMP-Spiegel induziert werden kann. Dies wird durch einen bereits vorhandenen Transkriptionsfaktor namens cAMP-Response-Element-bindender (CREB) Transkriptionsfaktor vermittelt. Einzelnukleotid-Polymorphismen, die häufig bei gesunden Menschen gefunden werden, beeinflussen die Promotoraktivität drastisch.

   In klinischen Studien wurden verschiedene Dosen von Vitamin E im Bereich von 400 IE bis 2.000 IE verwendet. Das Institute of Medicine, USA, empfiehlt eine empfohlene Nahrungsaufnahme (Recommended Dietary Intake, RDA) von 15–1.000 mg/Tag (1 mg = 1,5 IE; 22,5–1.500 IE/Tag). Wir verwenden sechs Monate lang eine Dosis von 400 IE. Es gibt keine Hinweise auf Nebenwirkungen, wenn es innerhalb der empfohlenen Tagesdosis eingenommen wird. In hohen Dosen kann es jedoch zu hämorrhagischer Toxizität kommen, insbesondere bei Patienten, die Antikoagulanzien einnehmen. Daher werden wir Patienten unter Antikoagulanzien ausschließen.

   3.0 Statistische Überlegungen

   3.1 Berechnung der Stichprobengröße: Die geschätzte Gesamtstichprobengröße für die Studie beträgt 300 Patienten. Die erforderliche Stichprobengröße von 100 für jedes Hp-Phänotyp-Stratum der RCT-Phase basiert auf: 5 % Typ-I-Fehler; 90 % Leistung; die Annahme, dass Vitamin E voraussichtlich mindestens einen moderaten Effekt hat, dargestellt durch eine standardisierte Effektgröße (mittlere Differenz/gepoolter Standardfehler) von 0,5, auf jeden Risikomarker; t-Test bei zwei Stichproben mit gleicher Varianz; und eine Abbrecherquote von 15 %. Geht man von einer Prävalenz von Hp 2-2 in unserer Bevölkerung von 35 % aus, müssen wir 300 Patienten untersuchen, um 100 Patienten mit Hp 2-2-Phänotyp zu rekrutieren.

   Unter Annahme einer mittleren RHI-Differenz von 0,25 Einheiten mit einer entsprechenden Standardabweichung (SD) von 0,3 ergibt sich eine standardisierte Effektgröße von 0,25/0,3 = 0,83 als minimaler Unterschied im RHI, der in einer anderen Studie beobachtet wurde. Aufgrund des Pilotcharakters der RCT sowie des explorativen Charakters der Studie im Allgemeinen haben wir keine Anpassungen für mehrere Tests/Vergleiche vorgenommen.

   Die Stichprobengröße für die In-vitro-Studie wird durch begrenzte Ressourcen eingeschränkt. Dennoch zeigen Simulationsergebnisse, die auf einem zweiseitigen Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Test, 5 % Typ-I-Fehler, einer Korrelation zwischen Paaren von 0,5 und 5000 Monte-Carlo-Simulationsstichproben basieren, dass 20 Paare eine ausreichende Leistung bieten, um mittlere bis große standardisierte Effektgrößen zu erkennen (M1).

   Die Randomisierung erfolgt elektronisch über das Internet – eine zentralisierte passwortgeschützte Intranet-Website, um sicherzustellen, dass die Patienten in dem Moment randomisiert werden, in dem sie für die Studie in Frage kommen (streng sequentiell). Für die Studie wird ein Block-Randomisierungsplan in Blöcken von 10 auf der Grundlage eines Verteilungsverhältnisses von 1:1 angewendet. Die dedizierte passwortgeschützte Seite weist dann eine eindeutige Patientenversuchsnummer zu, die den auf den Medikamentenschachteln angegebenen Behandlungsnummern entspricht. Nach der Randomisierung wird dem Patienten die erste Dosis verabreicht.

   3.2 Datenhandhabung und statistische Analysen: Datenhandhabung Alle relevanten Daten werden bei jedem Besuch und jeder telefonischen Nachuntersuchung unter Verwendung geeigneter, gut gestalteter Studiendatenerfassungsformulare erfasst. Alle Studiendaten werden in einer Studiendatenbank gespeichert, die nur vom Personal der Dateneingabe- und Datenvalidierungsstudie ausgewertet werden kann.

   Statistischer Analyseplan Daten zu demografischen und klinischen Ausgangsvariablen sowie Risikomarkern werden nach Hp-Phänotypen und insgesamt zusammengefasst, um einen Einblick in potenzielle Assoziationen zu geben. Binäre Daten werden anhand von Häufigkeit und Anteilen zusammengefasst. Der Chi-Quadrat-Test und der exakte Fisher-Test werden verwendet, um relevante Assoziationen (einschließlich der Vorteile von Vitamin E) zu bewerten, und, falls erforderlich, wird eine logistische Regression verwendet, um Assoziationen zu charakterisieren und gleichzeitig potenzielle Confounder zu berücksichtigen. Kontinuierliche Variablen werden je nach Bedarf unter Verwendung von Mittelwerten (Standardabweichungen) oder Medianwerten (Bereich) zusammengefasst. Zwei Stichproben-t-Tests oder Mann-Whitney-Tests werden verwendet, um relevante Assoziationen zu bewerten, und verallgemeinerte lineare Modelle werden verwendet, um Assoziationen zu charakterisieren und gleichzeitig potenzielle Confounder zu berücksichtigen. Verallgemeinerte lineare Modelle werden berücksichtigt, da sie bei Bedarf nicht-normale (asymmetrische) Daten oder log-normale Daten (z. B. Labordaten) berücksichtigen können. Für jedes relevante Ergebnis werden separate Tests und Modelle durchgeführt.

   Daten aus der In-vitro-Studie werden ähnlich wie im vorangehenden Absatz beschrieben nach Hp 2-2-Phänotypstatus und Vitamin-E-Konzentrationen zusammengefasst. Der Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Test wird verwendet, um die Vorteile von Vitamin E zwischen Hp-Phänotypgruppen nach Konzentrationen zu bewerten. Der Mann-Whitney- und Jonckheere-Terpstra-Test wird verwendet, um die Konzentrations-Nutzen-Beziehung von Vitamin E nach Hp-Phänotypgruppen zu bewerten. Verallgemeinerte lineare gemischte Modelle werden verwendet, um verschiedene Trends und Assoziationen zu untersuchen, wobei (i) die Übereinstimmung von Hp 2-2- und Nicht-Hp 2-2-Patienten, (ii) wiederholte Bewertungen innerhalb eines Patienten nach Vitamin-E-Konzentration, (iii) berücksichtigt werden. Bereinigung um potenzielle Confounder und (iv) Bereinigung um potenzielle Nicht-Normalität (Asymmetrie) der Daten durch Verwendung anderer geeigneter Verteilungen, wie z. B. Log-Normal- oder Gamma-Verteilungen. Es wird eine Gesamtanalyse der Daten aus der In-vitro-Studie durchgeführt.

   Die Bland-Altman-Analyse wird verwendet, um die Übereinstimmungsgrenzen für die Übereinstimmungs- und Zuverlässigkeitsstudien zu schätzen und zu bewerten. Gegebenenfalls wird ein gemischter Modellansatz verwendet, um die relevanten Zuverlässigkeitskoeffizienten zu schätzen und zu bewerten.

   5.0 Klinische Bedeutung

   Wenn ein Zusammenhang zwischen dem Hp 2-2-Phänotyp und dem kardiovaskulären Risiko besteht, kann diese Patientengruppe zusätzlich zu Statinen und anderen konventionellen Behandlungen zur Verringerung des kardiovaskulären Risikos mit Vitamin E behandelt werden. Zukünftige groß angelegte landesweite RCT können geplant werden, um zu sehen, ob die Behandlung mit Vitamin E hilft, das Risiko in dieser Patientengruppe zu reduzieren. Die Durchführung solcher Studien in einer multiethnischen Bevölkerung ist unerlässlich, da sie einen Einblick in die Konsistenz und Verallgemeinerbarkeit der erwarteten Vorteile bietet.