Relatie van haptoglobine fenotype tot vasculaire functie en respons op vitamine E-suppletie bij patiënten met diabetes mellitus type 2: de EVAS-studie (EVAS)

1.0 Achtergrond en klinische betekenis 1.1 Inleiding De incidentie van Diabetes Mellitus type 2 (DM2) neemt wereldwijd en in Singapore snel toe. De belangrijkste oorzaak van verhoogde morbiditeit en mortaliteit bij patiënten met DM2 is de ontwikkeling van microvasculaire en macrovasculaire complicaties. Hoewel is bewezen dat strikte glykemische controle microvasculaire complicaties vermindert, ontbreekt het bewijs nog steeds met betrekking tot macrovasculaire complicaties. Versnelde atherosclerose is de belangrijkste oorzaak van verhoogde mortaliteit en morbiditeit bij deze patiënten. Het is van het allergrootste belang om nieuwe doelen te beoordelen om atherosclerose onder controle te krijgen bij patiënten met DM2 bovenop de conventionele behandeling. Er is een onvervulde behoefte om nieuwe doelen of markers te vinden die een verhoogd risico voorspellen bij patiënten met diabetes mellitus en we moeten alternatieve behandelingen overwegen bovenop conventionele doelen om het risico bij deze patiënten met een hoog risico te verminderen.

Patiënten met DM2 lopen niet alleen een verhoogd risico op atherosclerose, ze dragen ook een groter deel van de ziektelast. Endotheliale disfunctie wordt beschouwd als het kenmerk van de pathologische beschadiging van de bloedvaten. Hyperglykemie beïnvloedt mitochondriale, enzymatische en niet-enzymatische routes die geassocieerd zijn met het genereren van reactieve zuurstofsoorten (ROS), wat leidt tot verminderde biologische beschikbaarheid van stikstofmonoxide en endotheliale disfunctie, vaak aangetoond door verminderde endotheelafhankelijke vasodilatatie en verhoogde plasmaspiegels van van endotheel afgeleide regulerende eiwitten. Bovendien hebben DM2-patiënten een aangetaste antioxidantafweer in de vorm van lage niveaus van de antioxidant-enzymen en alfa-tocoferol (vitamine E), wat een adequate compensatie voor de toename van oxidatieve stress kan belemmeren. Een andere rol van oxidatieve stress bij het mediëren van de ontwikkeling van atherosclerose is ook aangetoond in de oxidatieve hypothese. In dit model is het meest prominente doelwit voor oxidatieve modificatie het LDL-molecuul. Geoxideerd LDL wordt niet herkend door de LDL-receptor, maar wordt gemakkelijk opgenomen door de CD36-scavenger-receptorroute in macrofagen, wat leidt tot aanzienlijke accumulatie van cholesterylester en vorming van schuimcellen. Geoxideerd LDL is ontstekingsbevorderend, het veroorzaakt remming van endotheliaal NO-synthetase, bevordert vasoconstrictie en adhesie van monocyten, en bevordert aggregatie van bloedplaatjes en trombose.

HP-fenotype en oxidatieve weefselschade

Het haptoglobine (Hp) eiwit is een antioxidant vanwege zijn vermogen om de oxidatieve activiteit van hemoglobine (Hb) te neutraliseren. Bij mensen wordt Hp gekenmerkt door een genetisch polymorfisme met drie structureel verschillende fenotypes (Hp1-1, Hp 2-1 en Hp 2-2 die het gevolg zijn van de expressie van twee verschillende allelen (Hp 1 en Hp 2) van het haptoglobine-gen op chromosoom 16q22. Het eiwitproduct van het Hp2-allel is een inferieure antioxidant in vergelijking met het Hp1-allelproduct. Hp 1-1 is een klein molecuul (86 kDa) met een goed gedefinieerde structuur, terwijl Hp 2-1 wordt gekenmerkt door heteropolymeren (86-300 kDa) en Hp 2-2 vormt grote macromoleculaire complexen (170-1000 kDa).

De functie van Hp is het binden van vrij Hb dat vrijkomt uit rode bloedcellen en dat vrijkomt in het bloed tijdens de natuurlijke vernieuwing van rode bloedcellen. Vrij Hb kan door zijn heemijzer aanzienlijke oxidatieve weefselschade veroorzaken. Wanneer Hb echter in de bloedsomloop vrijkomt, bindt het zich onmiddellijk aan Hp met extreem hoge affiniteit om een ​​Hp-Hb-complex te vormen. Deze binding dient om het oxidatieve potentieel van Hb te remmen door de afgifte van heemijzer uit Hb te voorkomen. Hp wordt normaal gesproken in het bloed aangetroffen in een meer dan 400-voudige molaire overmaat om Hb vrij te maken en daarom is Hp in staat om al het Hb te binden dat vrijkomt tijdens de normale vernieuwing van rode bloedcellen. Als Hb eenmaal aan Hp is gebonden, wordt het snel uit de bloedbaan geklaard via de CD163-scavenger-receptor die tot expressie wordt gebracht op monocyten/macrofagen, maar de vorming en klaring van Hp-Hb-complexen wordt verstoord in Hp 2-2-fenotypes.

IJzer afgeleid van Hb kan een aantal oxidatieve reacties katalyseren die door Hp kunnen worden geremd.

1. Ferro-heemijzer (Fe2+) kan reageren met waterstofperoxide om ferri-Hb (Fe3+) en de zeer reactieve hydroxylradicaalspecies op te leveren. Door een waterstofatoom te onttrekken aan meervoudig onverzadigde vetzuren, kunnen hydroxylradicalen het proces van lipideperoxidatie op gang brengen.
2. Ferro-Hb (Fe2+) kan ook reageren met waterstofperoxide om ferryl-Hb (Fe4+) te produceren, een zeer onstabiel molecuul dat gemakkelijk reageert met een tweede molecuul waterstofperoxide om ferri-Hb (Fe3+) en superoxide-anion op te leveren. De schadelijke effecten van superoxide-anion zijn tweeledig: reductie van ferri-ijzer (Fe3+) in Hb tot ferro-ijzer (Fe2+), waardoor de productie van extra hydroxylradicaal mogelijk wordt zoals beschreven in reactie 1, en dismutatie van superoxide-anion om waterstofperoxide te produceren , waarmee opnieuw de productie van ROS wordt gepromoot.

3. IJzer-Hb (dat Fe3+ bevat), ook bekend als methemoglobine, kan zijn heemgedeelte spontaan overdragen, wat resulteert in het binnendringen van heem in diverse lipofiele omgevingen zoals LDL of celmembranen. Eenmaal geïntercaleerd in zijn nieuwe lipidenomgeving, kan heem-ijzer reacties ondergaan met waterstofperoxide zoals hierboven beschreven of met aangrenzende lipideperoxiden, waardoor een cascade van vrije radicalen ontstaat en uitgebreide lipide-oxidatie ontstaat.

   Als onderdeel van het Hp-Hb-complex stabiliseert Hp heem in de heempocket van Hb en voorkomt het dat Hb oxidatieve schade veroorzaakt. De mate waarin Hp de redoxactiviteit van heemijzer neutraliseert, verschilt echter per Hp-type. Dit is aangetoond in een aantal systemen, zowel in vitro als in vivo. Studies met linoleenzuur toonden bijvoorbeeld aan dat Hp 1-1 oxidatie (dieenvorming) verhinderde, zoals gemeten door een toename in absorptie bij 232 nm in grotere mate dan Hp 2-2. Een andere studie onderzocht LDL-oxidatie als gevolg van heemoverdracht van Hb naar LDL. Heemoverdracht werd gemeten door uitdoving van het fluorescentiesignaal uitgezonden door gedansyleerd LDL. Gevonden werd dat Hp 1-1 superieur was in het voorkomen van heemoverdracht van Hb in vergelijking met Hp 2-2.

   HP-fenotypes en cardiovasculaire risico's Studies hebben aangetoond dat Hp 2-2 Hb-complexen ook minder efficiënt worden geklaard dan niet-Hp 2-2 Hb-complexen. Bij DM2-patiënten is dit fenomeen meer uitgesproken vanwege de neerwaartse regulatie van CD163, vooral bij Hp 2-2-individuen. Een stoornis in ontstekingsremmende macrofaagsignalering via een CD163/pAkt/IL-10-as wordt ook waargenomen bij Hp 2-2-patiënten.

   Hp-Hb-deficiënte klaring bij Hp 2-2 DM2-individuen resulteert in verhoogde Hp-Hb-binding aan Apo A1 op lipoproteïne met hoge dichtheid (HDL-C), waardoor de pro-oxidatieve heemgroep aan HDL wordt gebonden. Dit maakt het ontoereikend in zijn vermogen om de overdracht van cholesterol van macrofagen om te keren.

   Het Hp 2-2-eiwit is minder efficiënt in het blokkeren van heemoverdracht van Hb in vergelijking met Hp 1-1. Bovendien kan de toename van de heemoverdracht wanneer Hb geglycosyleerd is, een mechanistische verklaring zijn voor de toename van hart- en vaatziekten die wordt waargenomen bij Hp 2-2 DM2.

   Vandaar dat Hp 2-2-fenotype wordt geassocieerd met een verminderd vermogen om te binden met Hb, verminderde klaring van Hp 2-2 Hb-complexen, verslechtering van de ontstekingsremmende signaalroute, verhoogde LDL-oxidatie, maakt HDL-cholesterol inefficiënt en minder efficiënt in het blokkeren van heemoverdracht van Hb tot Hp 1-1, allemaal leidend tot een hoger cardiovasculair risico. Bij diabetespatiënten bij wie sommige van deze routes ook worden beïnvloed, wordt het synergetische effect van hyperglykemie en het haptoglobine-fenotype verergerd, wat leidt tot een hoger risico.

   In longitudinale studies uitgevoerd in andere populaties is gezien dat het Hp 2-2 genotype geassocieerd is met een 2- tot 5-voudig verhoogd risico op hart- en vaatziekten bij personen met DM. Met name de sterke hartstudie was de oddsratio van het hebben van HVZ bij DM met het Hp 2-2-fenotype 2-5 keer groter dan bij DM met Hp 2-1-fenotype (p=0,002). In de München Stent-studie werd een opeenvolgende reeks van 935 behandelde diabetespatiënten gedurende één jaar gevolgd na het plaatsen van een stent op ernstige ongunstige cardiale gebeurtenissen. In deze studie werd gezien dat het fenotype haptoglobine 2-2 een onafhankelijke voorspeller was van ernstige ongunstige cardiale gebeurtenissen. Bovendien is gezien dat vitamine E een aanzienlijk cardiovasculair voordeel biedt aan Hp 2-2 DM-patiënten in één populatie (Israel-ICARE STUDY) en post-hoc analyse van de WHS (Women Health Study) en HOPE-studie om te zien of vitamine E E-suppletie in een subgroep van patiënten met de door haptoglobine 2-2 fenotype beïnvloede mortaliteit toonde een niet-significante vermindering van de totale mortaliteit. Dit is niet algemeen aanvaard omdat grotere onderzoeken en bij meerdere populaties nodig zijn om de associatie en voordelen te onderbouwen.

   HP-fenotype en etniciteit

   In een lokale studie die in Singapore is uitgevoerd, is gezien dat de frequentie van de Hp-genen als volgt varieert in de verschillende etniciteiten: Chinese Hp1: 0.330; Hp2: 0.670; Hp0: 0,029; Maleiers:Hp1:0.298;Hp2:0.702 ;Hp0:0.004; Indiërs Hp1: 0.167;Hp2:0.833;Hp0:0.009. Er is gezien dat de verdeling van de Hp-frequenties in onze populatie een Hardy-Weinberg-evenwicht heeft, vandaar dat de verwachte prevalentie van Hp 2-2 ongeveer 30-40% is. De Hp-fenotypes zullen worden bepaald door TaqMan-analyse in het TTSH Research Laboratory.

   1.2 Genotypes van haptoglobine en endotheliale functie

   Endotheeldisfunctie krijgt steeds meer aandacht als mogelijke bijdrage aan de pathogenese van vasculaire aandoeningen bij DM. Bij DM2 wordt het natuurlijke delicate evenwicht in het vrijkomen van samentrekkende en ontspannende factoren door het endotheel verstoord, wat bijdraagt ​​aan verdere vasculaire en eindorgaanschade. Gepostuleerd wordt dat een verminderde endotheliale functie een laatste gemeenschappelijke route biedt waarlangs meerdere risicofactoren hun schadelijke effecten uitoefenen op de cardiovasculaire gezondheid en is vastgesteld als een krachtige surrogaatmarker voor cardiovasculair risico, waarbij één studie een nog betere voorspelbaarheid aantoonde dan de Framingham-risicoscore. Het EndoPAT 2000-apparaat zal worden gebruikt omdat dit is ontwikkeld voor het schatten van de endotheliale functie op een niet-invasieve manier.

   Er zijn geen directe onderzoeken gedaan naar een associatie van Hp-genotypes met de endotheelfunctie. In één pilotstudie waarin de endotheelfunctie werd beoordeeld met behulp van post-ischemische reactieve hyperemie en rekstrookje-plethysmografie en uitgedrukt als maximale stroom na een ischemische periode, werd gezien dat Hp 2-2-patiënten met diabetes een slechtere endotheliale functie hadden in vergelijking met niet-Hp 2-2-patiënten (450 +-50 versus 600+-40).

   1.3 Haptoglobine genotypen en CIMT (Carotid intima media thickness)

   In de Diabetes Heart-studie toonden genetische analyses van Hp-genotypes een verband aan tussen het Hp 2-2-genotype en de dikte van de intima media van de halsslagader (CIMT). Deze metingen worden uitgevoerd terwijl de proefpersoon ligt, met het hoofd uitgestrekt en lichtjes gedraaid tegenover de onderzochte halsslagader, volgens de aanbevelingen van de Mannheim CIMT-consensus. Twee onderzoekers hebben de CIMT geschat bij 23 personen en er is een Bland-Altman-grafiek uitgezet. en de limieten van overeenstemming tussen gebruikers bleken binnen -0,1 tot +0,1 te liggen.

   1.4 Haptoglobine-genotypes en stijfheid van de aortaslagader

   Hoewel er geen directe studies zijn gedaan waarin Hp-genotypes en aorta-slagaderstijfheid werden vergeleken, is er één studie gedaan waarin de arteriële elasticiteit van grote en kleine slagaders werd geëvalueerd met behulp van de pulsgolfcontouranalysemethode. De elasticiteitsindex van de grote arterie was lager bij patiënten met Hp 2-2 in vergelijking met Hp 1-1 (8,4 ± 2,3 ml/mmHg versus 12,6 ± 4,1 ml/mmHg x 100; p

   Verhoogde vasculaire stijfheid is vroeg in het verloop van diabetes mellitus type 2 waargenomen bij gebruik van een sphygmocor-apparaat. Het is waarschijnlijk dat deze stijfheid eerder verband houdt met endotheliale disfunctie dan met structurele vasculaire veranderingen - dit suggereert op zijn beurt dat het omkeerbaar is. Aorta-pulsgolfsnelheid (PWV), een maat voor aorta-uitrekbaarheid, blijkt ook de mortaliteit van patiënten met diabetes te voorspellen, onafhankelijk van bekende verstorende factoren. Het SphygmoCor Xcel-apparaat zal worden gebruikt om de stijfheid van de aortaslagader te schatten met behulp van de golfsnelheid van de halsslagader naar de dijbeenpuls en de centrale aortadruk. De onderzoekers schatten de pulsgolfsnelheid bij 20 personen om de grenzen van overeenstemming vast te stellen met behulp van de Bland-Altman-grafiek voordat ze met het onderzoek beginnen.

   1.5 Haptoglobine-genotypes en vasculaire markers

   Vasculair celadhesiemolecuul-1 (VCAM-1) en intercellulair adhesiemolecuul-1 (ICAM-1) zijn eiwitten die tot expressie worden gebracht op het oppervlak van geactiveerde endotheelcellen (EC's) en tot expressie worden gebracht in vroege atherosclerose. Deze markers zijn geëvalueerd en worden beschouwd als goede markers van endotheliale disfunctie omdat een deel van het eiwit in de bloedsomloop wordt uitgescheiden en in perifeer plasma kan worden gedetecteerd.

   1.6 Haptoglobine genotypen en fenotypering van plasmalipiden

   Het fenotype HP 2-2 is in verband gebracht met hogere geoxideerde LDL-concentraties, die voornamelijk betrokken zijn bij atherosclerose. Het is ook bekend dat de concentraties van Apo-A1 HDL hoger zijn in deze groep patiënten. Het HP 2-2-fenotype kan ook in verband worden gebracht met hogere Lp(a)-concentraties, waardoor deze patiënten een hoger cardiovasculair risico lopen. Gedetailleerde fenotypering van plasmalipiden met behulp van proteomics om nieuwe associaties te zoeken zal worden gedaan.

   1.7 Haptoglobine-genotypes en oxidatieve stress

   Het is bekend dat het Hp 2-2 genotype een hogere oxidatieve stress op het endotheel veroorzaakt. Het totale oxidatiepotentieel wordt berekend als de Oxidatief-INDEX. Twee tests zullen als volgt worden uitgevoerd om deze index te berekenen. Deze index is vastgesteld als een goede schatting van de algehele oxidatieve stress.

   1. d-ROMs-test: Deze test wordt uitgevoerd op serummonsters met behulp van de geautomatiseerde d-ROMs-methode. (Vassalle C, Pratali L, Boni C, Mercuri A, Ndreu R. Een oxidatieve stressscore als een gecombineerde maatstaf van de pro-oxidant en anti-oxidant tegenhangers bij patiënten met coronaire hartziekte. Clin Biochem 2008;41:1162-7)
   2. FRAP (ferri-reducerend vermogen van plasma - een maatstaf voor het vermogen van het plasma om schade aan vaten te voorkomen) en d-ROM's (derivaten voor de reactieve zuurstofmetabolieten) zullen worden gebruikt om de oxidatieve stressscore te berekenen.

   Andere markers van oxidatieve stress zullen ook gemeten worden zoals glyoxal, methylglyoxal, asymmetrische dimethylarginine en homoarginine.

   1.8 Haptoglobine-genotypes en retinale arterioveneuze index

   De aanwezigheid van retinale microvasculaire afwijkingen, met name arteriële vernauwing en venulaire dilatatie, is in verband gebracht met een verhoogd cardiovasculair risico en is in verband gebracht met endotheliale disfunctie en ontsteking. Momenteel zijn er geen studies die kijken naar de relatie tussen Hp-genotypes en retinale arterioveneuze (AV) index. . Voorafgaand aan het onderzoek worden oogdruppels gedruppeld om de pupillen te verwijden voor fundusonderzoek en om het hoornvlies te smeren. Retinale beeldvorming zal worden gedaan voor de proefpersonen in de oogkliniek. Als patiënten niet willen deelnemen aan de retinale beeldvorming, kunnen ze ervoor kiezen om af te zien van de retinale beeldvormingstest.

   2.0 Vitamine E, haptoglobine fenotype en cardiovasculaire risicoreductie

   Hoewel functionele verschillen tussen Hp1- en Hp2-allelische eiwitproducten, met name bij diabetes mellitus, de verschillen in vatbaarheid voor complicaties bij de Hp 2-2-individuen van niet-Hp 2-2-individuen kunnen verklaren, is de belangrijkste reden van het unieke voordeel van vitamine E dat redoxactief Hb wordt alleen geassocieerd met HDL bij HP 2-2 DM-individuen. Bij patiënten met DM resulteren verlaagde Hp-Hb-complexen in verhoogde Hp-Hb-binding aan Apo-A1 op high-density lipoprotein (HDL), waardoor de pro-oxidatieve heemgroep aan HDL wordt gebonden. HDL bij HP 2-2 DM-individuen heeft een tekort aan het vermogen om de omgekeerde overdracht van cholesterol van macrofagen te stimuleren. Daarnaast wordt het Hp-fenotype 2-2 geassocieerd met verhoogde oxidatieve stress als gevolg van onvoldoende klaring van vrije radicalen en verhoogde LDL-peroxidatie.

   Vitamine E is een krachtige antioxidant met ontstekingsremmende eigenschappen. Het verlicht aanzienlijk de conditie van oxidatieve stress door zowel zijn krachtige vrije radicalen wegvangende eigenschappen als door directe en sterke interactie met de antioxidante enzymen. Vitamine E-suppletie bij mensen en diermodellen heeft aangetoond dat het de lipideperoxidatie en de productie van superoxide vermindert en de expressie van scavenger-receptoren (SR-A en CD36) vermindert, die vooral belangrijk zijn bij de vorming van schuimcellen. Hoewel niet is bewezen dat vitamine E nuttig is bij het verminderen van het cardiovasculaire risico in de algemene bevolking, is het nuttig geweest bij patiënten met het HP 2-2-fenotype met DM, beide aandoeningen die de oxidatieve stress aanzienlijk verhogen in onderzoeken die bij één populatie zijn uitgevoerd.

   Er zijn slechts drie interventionele gerandomiseerde gecontroleerde onderzoeken (RCT's) geweest waarin de enige antioxidant die de DM-deelnemers kregen vitamine E was en waarin het Hp-type van de studiedeelnemers werd bepaald. De ICARE-studie was de enige RCT die gericht was op het evalueren van vitamine E bij DM-patiënten voor wie het Hp-genotype prospectief werd verzameld. In deze studie werden 1.434 DM-individuen > of = 55 jaar met het Hp 2-2-fenotype gerandomiseerd naar vitamine E (400 IE/dag/placebo). Het primaire samengestelde resultaat was significant lager bij personen die vitamine E kregen (2,2%) in vergelijking met placebo (4,7%, p=0,001) 18 maanden na aanvang van de studie toen deze werd beëindigd. Bovendien werden bloedmonsters van een subgroep van patiënten die waren gerekruteerd voor de WHS- en HOPE-onderzoeken geanalyseerd op Hp-polymorfisme, en de uitkomsten werden opnieuw beoordeeld op basis van het Hp-type van de patiënt. In al deze onderzoeken werd een hoger risico op cardiovasculaire gebeurtenissen gezien bij Hp 2-2-individuen en werd in deze groep een voordeel van vitamine E-suppletie gezien.

   2.1 Verantwoording voor dosis en duur van vitamine E (alfa-tocoferol).

   We zullen vitamine E 400 IE per dag gebruiken en een gematchte placebo. We zullen de firma Beacons opdracht geven om de vitamine E-capsules (400 IE) en de bijpassende placebo-capsules te maken. Vitamine E-preparaat zal het natuurlijke tocoferol zijn dat voorkomt in de RRR-configuratie. We zullen gedurende 6 maanden vitamine E 400 IE geven, aangezien de meeste onderzoeken met surrogaatmarkers van cardiovasculair risico een verbetering hebben gezien in 6 maanden na suppletie. Bovendien werd in de bovengenoemde ICARE-studie een verbetering van de cardiovasculaire uitkomst gezien na 18 maanden, wat suggereert dat 6 maanden voldoende zou moeten zijn om een ​​verbetering te zien in surrogaatmarkers van cardiovasculair risico.

   De acht vormen van vitamine E zijn verdeeld in twee groepen; vier zijn tocoferolen en vier zijn tocotriënolen. Ze worden geïdentificeerd door de voorvoegsels alpha- (α-), beta- (β-), gamma- (γ-) en delta- (δ-). alfa-tocoferol is de meest voorkomende vorm in de natuur, waarvan bekend is dat het de hoogste biologische activiteit heeft op basis van foetale resortietesten en symptomen van vitamine E-tekort bij mensen omkeert. Natuurlijke tocoferolen komen alleen voor in de RRR-configuratie. De synthetische vorm bevat acht verschillende stereo-isomeren en wordt 'all-rac'-α-tocoferol genoemd.

   Vitamine E komt in zijn natuurlijke vorm voor in plantaardige oliën (tarwekiem-, zonnebloem-, saffloer-, maïs- en sojaolie), noten (amandelen, pinda's en hazelnoten), zaden (zonnebloempitten), groene bladgroenten (spinazie en broccoli) en verrijkte ontbijtgranen, vruchtensappen, margarine en beleg. De aanbevolen inname van het Institute of Medicine voor individuen is ongeveer 15 mg/dag. Het hoogste veilige niveau van vitamine E-supplementen voor volwassenen is 1.500 IE/dag voor natuurlijke vormen van vitamine E en 1.000 IE/dag voor de door de mens gemaakte (synthetische) vorm. Populaire vitamine E-supplementen die beschikbaar zijn, omvatten D-alfa-tocoferol dat is afgeleid van natuurlijke oliën. In de handel verkrijgbare vitamine E-supplementen bevatten gewoonlijk alleen alfa-tocoferol, hetzij onveresterd, hetzij als de ester van acetaat, succinaat of nicotinaat. Bij mensen hebben vrij en veresterd alfa-tocoferol dezelfde biologische beschikbaarheid. Supplementen kunnen de natuurlijke RRR- of synthetische (all-rac) alfa-tocoferol bevatten. De biologische activiteit van natuurlijke RRR alfa-tocoferol is hoger dan die van synthetische all-rac-alfa-tocoferol en andere natuurlijke vormen van vitamine E.

   Zowel oxidatieve stress als individuele genetische make-up dragen bij aan vitamine E-homeostase bij mensen en dit kan verantwoordelijk zijn voor de variabele klinische effecten die worden waargenomen bij verbetering van klinische variabelen in klinische onderzoeken. Vitamine E wordt geabsorbeerd in de darm, komt de circulatie binnen via het lymfestelsel waar het samen met lipiden wordt geabsorbeerd, verpakt in chylomicronen en getransporteerd naar de lever. Na passage door de lever verschijnt bij voorkeur alleen alfa-tocoferol in het plasma en de meeste andere vormen van vitamine E worden bij voorkeur gemetaboliseerd en uitgescheiden in de gal of niet opgenomen en uitgescheiden in de feces. In de lever sorteert hepatisch alfa-tocoferoloverdrachtseiwit (α-TTP) specifiek de α-vorm met de 2R-stereo-isomeren. Plasma RRR-α-tocoferol opname is een verzadigbaar proces. Plasmaspiegels van RRR-α-tocoferol nemen niet meer toe bij ongeveer 80 μM, ondanks toenemende doseringen van vitamine E-suppletie tot 1.320 mg all-rac-α-tocoferol per dag. Dit is waarschijnlijk secundair aan de snelle vervanging van circulerend door nieuw geabsorbeerd α-tocoferol en kinetische analyses tonen aan dat de hele pool van α-tocoferol dagelijks wordt vervangen. Bij mensen is de preferentiële accumulatie van α-tocoferol in het lichaam afhankelijk van zowel een functioneel α-TTP als een verhoogd metabolisme en uitscheiding van niet-α-tocoferolen. Het alfa-tocoferol-overdrachtseiwit reguleert de distributie en concentraties van vitamine E door het hele lichaam door de uitscheiding van vitamine E uit de lever te regelen. Er is gezien dat de expressie van het gen voor alfa-tocoferoloverdrachtseiwit kan worden geïnduceerd door oxidatieve stress en hypoxie, door agonisten van de nucleaire receptor PPARa en RXR, en door cAMP-niveaus te verhogen. Dit wordt gemedieerd door een reeds aanwezige transcriptiefactor genaamd cAMP responselement-bindende (CREB) transcriptiefactor. Single-nucleotide polymorfismen die vaak worden aangetroffen bij gezonde mensen hebben een drastische invloed op de promotoractiviteit.

   In klinische onderzoeken zijn verschillende doses vitamine E gebruikt, variërend van 400 IE tot 2.000 IE. Het Institute of Medicine in de VS stelt een aanbevolen inname via de voeding (ADH) voor van 15-1.000 mg/dag (1 mg = 1,5 IE; 22,5-1.500 IE/dag). We gebruiken een dosis van 400 IE gedurende zes maanden. Er zijn geen aanwijzingen voor nadelige effecten indien ingenomen binnen de ADH. Bij hoge doseringen kan er echter hemorragische toxiciteit optreden, vooral bij patiënten die anticoagulantia gebruiken. Daarom sluiten we patiënten op antistollingsmiddelen uit.

   3.0 Statistische overwegingen

   3.1 Berekening van de steekproefomvang: De totale geschatte steekproefomvang voor het onderzoek is 300 patiënten. De vereiste steekproefomvang van 100 voor elk Hp-fenotype-stratum van de RCT-fase is gebaseerd op: 5% type I-fout; 90% vermogen; de aanname dat vitamine E naar verwachting ten minste een matig effect heeft, vertegenwoordigd door een gestandaardiseerde effectgrootte (gemiddeld verschil/gepoolde standaardfout) van 0,5, op elke risicomarker; two-sample t-toets met gelijke variantie; en een uitvalpercentage van 15%. Uitgaande van een prevalentie van Hp 2-2 van 35% in onze populatie, moeten we 300 patiënten screenen om 100 Hp 2-2-fenotypepatiënten te rekruteren.

   Uitgaande van een gemiddeld verschil op RHI van 0,25 eenheden met overeenkomstige standaarddeviatie (SD) van 0,3 - wat resulteert in een gestandaardiseerde effectgrootte van 0,25/0,3 = 0,83 als minimaal verschil in RHI gezien in een andere studie. We hebben niet gecorrigeerd voor meerdere tests/vergelijkingen vanwege het pilotkarakter van de RCT en het verkennende karakter van het onderzoek in het algemeen.

   De steekproefomvang voor de in vitro studie wordt beperkt door beperkte middelen. Desalniettemin geven simulatieresultaten op basis van een tweezijdige Wilcoxon Signed-Ranked-test, 5% type I-fout, een correlatie tussen paren van 0,5 en 5000 Monte Carlo-simulatiemonsters aan dat 20 paren voldoende vermogen bieden om matige tot grote gestandaardiseerde effectgroottes te detecteren. (M1).

   Randomisatie zal elektronisch gebeuren via het web - een gecentraliseerde met een wachtwoord beveiligde intranetwebsite om ervoor te zorgen dat de patiënten worden gerandomiseerd op het moment dat ze in aanmerking komen voor de studie (strikt opeenvolgend). Voor het onderzoek wordt een geblokkeerd randomisatieschema gehanteerd, in blokken van 10, gebaseerd op een allocatieverhouding van 1:1. De speciale, met een wachtwoord beveiligde site zal dan een uniek proefnummer voor de patiënt toewijzen dat overeenkomt met de behandelingsnummers die op de medicatiedozen staan ​​vermeld. Na randomisatie zal de eerste dosis aan de patiënt worden toegediend.

   3.2 Gegevensverwerking en statistische analyses: Gegevensverwerking Alle relevante informatie wordt verzameld met behulp van geschikte, goed ontworpen onderzoeksgegevensverzamelingsformulieren bij elk bezoek en telefonische follow-upbeoordeling. Alle onderzoeksgegevens worden opgeslagen in een onderzoeksdatabase die alleen toegankelijk is voor onderzoekspersoneel voor gegevensinvoer en gegevensvalidatie.

   Plan voor statistische analyse Gegevens over demografische en klinische basisvariabelen en risicomarkers zullen worden samengevat per Hp-fenotype en in het algemeen om inzicht te geven in mogelijke verbanden. Binaire gegevens worden samengevat met behulp van frequentie en verhoudingen. Chi-kwadraattest en Fisher exact-test zullen worden gebruikt om relevante associaties te evalueren (inclusief voordelen van vitamine E), en indien nodig zal logistische regressie worden gebruikt om associaties te karakteriseren terwijl wordt gecorrigeerd voor mogelijke confounders. Continue variabelen zullen worden samengevat met behulp van gemiddelden (standaarddeviaties) of mediaan (bereik) zoals passend wordt geacht. Two-sample t-test of Mann-Whitney-test zal worden gebruikt om relevante associaties te evalueren en gegeneraliseerde lineaire modellen zullen worden gebruikt om associaties te karakteriseren terwijl wordt gecorrigeerd voor mogelijke confounders. Gegeneraliseerde lineaire modellen worden overwogen omdat ze indien nodig niet-normale (asymmetrische) gegevens of log-normale gegevens (zoals laboratoriumgegevens) kunnen bevatten. Voor elke relevante uitkomst zullen afzonderlijke tests en modellen worden uitgevoerd.

   De gegevens van het in vitro onderzoek zullen op dezelfde manier worden samengevat als beschreven in de voorgaande paragraaf, op basis van de status van het Hp 2-2-fenotype en de vitamine E-concentraties. Wilcoxon Signed-Ranked-test zal worden gebruikt om de voordelen van vitamine E tussen Hp-fenotypegroepen door concentraties te evalueren. Mann-Whitney en Jonckheere-Terpstra-test zullen worden gebruikt om de concentratie-batenrelatie van vitamine E door Hp-fenotypegroepen te evalueren. Er zullen gegeneraliseerde lineaire gemengde modellen worden gebruikt om verschillende trends en associaties te onderzoeken, waarbij rekening wordt gehouden met (i) de afstemming van Hp 2-2- en niet-Hp 2-2-patiënten, (ii) herhaalde beoordeling binnen een patiënt door vitamine E-concentratie, (iii) aanpassing voor potentiële confounders, en (iv) aanpassing voor mogelijke niet-normaliteit (asymmetrie) van de gegevens door andere geschikte distributies te gebruiken, zoals log-normale of gamma-distributies. Er zal een algemene analyse van de gegevens van de in vitro studie worden uitgevoerd.

   Bland-Altman-analyse zal worden gebruikt om de limieten van overeenstemming voor de overeenstemmings- en betrouwbaarheidsstudies te schatten en te evalueren. Waar van toepassing zal een gemengde modelbenadering worden gebruikt om de relevante betrouwbaarheidscoëfficiënten te schatten en te evalueren.

   5.0 Klinische betekenis

   Als er een verband wordt gezien tussen het Hp 2-2-fenotype en cardiovasculair risico, kan deze groep patiënten worden gericht op vitamine E-behandeling bovenop statines en andere conventionele behandelingen om het cardiovasculaire risico te verminderen. Toekomstige grootschalige landelijke RCT kan worden gepland om te zien of vitamine E-behandeling helpt om het risico bij deze groep patiënten te verminderen. Het uitvoeren van dergelijke studies in een multi-etnische populatie is absoluut noodzakelijk omdat het inzicht verschaft in de consistentie en generaliseerbaarheid van de verwachte voordelen.